הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה
Summary
הכנת גלולה חיידקים מהירה מתרבית דם חיובית יכולה לשמש כמדגם עבור יישומים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF, צביעת גראם, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת PCR מבוססת. התוצאות ניתן להעביר במהירות לרופאים כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם.
Abstract
זיהומים ואלח דם דם הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. התוצאה המוצלחת של חולים הסובלים מבקטרמיה תלויה בזיהוי מהיר של הגורם המדבק להנחות טיפול אנטיביוטי אופטימלי. הניתוח של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יכול להתנהל במהירות וכבר להשפיע על המשטר האנטיביוטי באופן משמעותי. עם זאת, זיהוי מדויק של הגורם המדבק עדיין יידרש לקבוע את הטיפול האופטימלי ממוקד. אנו מציגים כאן הכנת גלולה חיידקים פשוטה ומהירה מתרבית דם חיובית שיכול לשמש כדוגמה לכמה יישומים במורד הזרם חיוניים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF MS, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) על ידי assay דיפוזיה דיסק או מערכות AST אוטומטיות ועל ידי אוטומטי PCR מבוסס בדיקות אבחון. הביצועים של מערכות זיהוי וAST אלה שונים מיושמים ישירות על כדורי חיידקי תרבית הדם הוא מאוד siמילר לביצועים בדרך כלל מתקבל ממושבות מבודדות גדלו על צלחות אגר. בהשוואה לגישות קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן כדי לדווח על זיהוי שני וAST. לפיכך, החיוביות הבאה דם התרבות, זיהוי על ידי MALDI-TOF ניתן לדווח בתוך שעה פחות מ 1 ואילו תוצאות של AST ידי מערכות AST אוטומטיים או מבחני דיפוזיה הדיסק בתוך 8 עד 18 שעות, בהתאמה. באופן דומה, התוצאות של assay PCR מבוסס מהיר ניתן להעביר לרופאים פחות משעה 2 בעקבות הדו"ח של בקטרמיה. יחד, תוצאות אלו מראות כי ההכנה המהירה של גלולה חיידקי תרבית דם יש השפעה משמעותית על זמן זיהוי ותפנית AST ובכך על התוצאות המוצלחות של חולים הסובלים מזיהומים בדם.
Introduction
זיהומים בדם ואלח דם בחולים מאושפזים הם אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה. כך, תמותה הקשורים לזרם דם זיהומים הוא ציין ב% על 14 ל37% ממטופל מאושפז ועלולה להגביר 35% ביחידות לטיפול נמרצים לחולי 1-3. זיהוי המהיר של הגורם המדבק הוא מרכזי שינחה את טיפול מיקרוביאלית אופטימלי ולהגדיל את התוצאה המוצלחת של 4,5 טיפול האנטיביוטי. הניתוח המהיר של כתמים גרם מתרבית דם חיובית יש כבר השפעה משמעותית על ההסתגלות של טיפול האנטיביוטי 6,7 אבל זיהוי מדויק של הגורם המדבק נדרש לספק הטיפול האנטיביוטי המותאם הטוב ביותר לחולים. למשל, משטרי טיפול אנטיביוטי שונים צריכים להיות מיושמים, לאחר בקטרמיה עם Enterococci וסטרפטוקוקוס שקשה להבחין על ידי צביעת גראם. באופן דומה, זיהוי במיני לבאל דרוש כדי לאתר enterobacteria השלילי גרם קידוד גן ampC כרומוזומליות מקנות התנגדות מוגברת לβ-lactams 8.
עם תרבית דם חיובית, הגישה לאבחון הקונבנציונלית היא תת הגורם המדבק על צלחות אגר שונות, אשר דורש כמה שעות של זיהוי לפני דגירה נוספת עם גישות שונות, כוללים בדיקות ביוכימיות, צמיחה בתקשורת סלקטיבית שונה ומערכות זיהוי חיידקים אוטומטיות. הזמן לתוצאות של גישת אבחון קונבנציונלית הוא של כ 1 עד 3 ימים.
הופעתה של טכנולוגית הלייזר desorption בסיוע מטריקס / ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסת יינון (MALDI-TOF) לזיהוי מהיר של מיקרואורגניזמים סיפקה כלי חדש כדי לזהות במהירות מיקרואורגניזמים ממושבות גדלו על צלחות אגר אלא גם ישירות מהדם חיובי תרבויות (איור 1) 9-12. השימוש בדואר של MALDI-TOF לזהות גורם מזהם מתרביות דם צמצם באופן משמעותי את הזמן לתוצאות לכמה דקות במקום שעות וימים הנדרשים על ידי שיטות מסורתיות. כפי שנאמר על ידי Croxatto et al. 13, את היעילות של זיהוי MALDI-TOF מסתמכת על פרמטרים שונים כולל טוהר של מיקרואורגניזם וכמות. שני קריטריונים אלו מתקבלים בקלות ממושבות דיסקרטיות גדלו על צלחות אגר אבל נדרשו טיפול קדם אנליטיים להעשרת חיידקים וטיהור מדגימות מורכבות כגון תרבות דם, אשר מכילות מרכיבים תאיים וחלבון מרובים שעלולים להפריע לזיהוי MALDI-TOF.
שיטות צנטריפוגה שיטות בידוד מיקרואורגניזמים שונים מתרבות דם כבר בשימוש במספר המחקרים כולל saponin או שיטת חומרי ניקוי עדין אחרת להפקת חיידקים 9,14, שיטה מפריד בסרום 10, תמוגה 12 </sעד> ופתרונות מסחריים כגון ערכת sepsityper. המעבדה לאבחון בקטריולוגיה פיתחה הכנת גלולה חיידקים בדם תרבות פשוטה המבוססת על כדורית אדומה-תמוגה אמוניום כלוריד המאפשר זיהוי מהיר של חיידקים ושמרים על ידי MALDI-TOF ומערכות זיהוי אוטומטי (איור 2) 15. הכנת גלולה דם תרבות זו גם מספקת לדוגמה עבור יישומים במורד הזרם ישירים אחרים כגון צביעת גראם, בדיקות אבחון המבוססת על PCR אוטומטיים כגון POCT-PCRs לזיהוי המהיר של methicillin עמיד Staphyloccocus aureus (MRSA), ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה עם מערכות אוטומטיות AST ו / או על ידי מבחני דיפוזיה דיסק על צלחות אגר (איור 3).
בעבודה זו, אנו מתארים את השלבים השונים של הכנת גלולה חיידקים בדם התרבות כפי שהוסבר על ידי Prod'hom et al. 15 (איור 4). אנו גם דהסופר הפרוטוקולים עבור שלושה היישומים העיקריים שיכול להתבצע על גלולה תרבות דם: זיהוי על ידי 15 MALDI-TOF, זיהוי (ID) ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) עם המערכות האוטומטיות 16 לEnterobacteriaceae וstaphylococci וPCR- האוטומטי בדיקת אבחון המבוסס על זיהוי של MRSA 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהשוואה לגישות אבחון תרבית דם החיובית קונבנציונליות, הרכישה המהירה של גלולה חיידקים על ידי שימוש בגישת צנטריפוגה אמוניום כלוריד תמוגה לצמצם את הזמן לדווח זיהוי על ידי 16 עד 24 שעה והזמן לדווח AST ידי 24 עד 48 שעה (איורים 1 ו 3).
?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לטכנאים של המעבדה בקטריולוגיה של מרכז בית החולים של האוניברסיטה של לוזאן לעזרתם כדי ליישם את הטכניקות במעבדה.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Riferimenti
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
