Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам
Summary
Быстрое бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови может быть использована в качестве образца для таких применений, как идентификации по MALDI-TOF, окрашивание по Граму, тестирование чувствительности к антибиотикам и тест на основе ПЦР. Полученные результаты могут быть быстро доведены до врачей, чтобы улучшить результаты лечения больных, страдающих от инфекций кровотока.
Abstract
Инфекций кровотока и сепсис являются одной из основных причин заболеваемости и смертности. Успешное завершение пациентов, страдающих от бактериемии зависит от быстрой идентификации инфекционного агента, чтобы вести оптимальное лечение антибиотиками. Анализ грамотрицательных пятна от положительной культуры крови может быть проведено быстро и уже существенно повлиять на режим антибиотиками. Тем не менее, точная идентификация возбудителя инфекции по-прежнему требуется, чтобы установить оптимальный целенаправленного лечения. Приведем здесь простой и быстрый бактериальный препарат гранул с положительной культуры крови, которые могут быть использованы в качестве образца в течение нескольких существенных последовательных применений, таких как идентификация по MALDI-TOF MS, тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) на диск диффузии анализа или автоматизированных систем AST и автоматизированная основе ПЦР диагностическое тестирование. Производительность этих различных идентификационных и АСТ систем, применяемых непосредственно на посев крови бактериальных гранул очень сиMilar к производительности обычно получают из изолированных колоний, выросших на чашках с агаром. По сравнению с традиционными подходами, быстрое приобретение бактериальной гранул значительно снижает время, чтобы сообщать как идентификацию и АСТ. Таким образом, следующие культура положительность крови, идентификация MALDI-TOF может быть сообщено в течение менее 1 ч, тогда как результаты АСТ автоматизированными системами AST или диск диффузии анализов в пределах от 8 до 18 часов, соответственно. Точно так же результаты экспресс ПЦР-анализа могут быть доведены до сведения врачей менее 2 ч после доклада на карбункул. Вместе, эти результаты показывают, что быстрое приготовление питательной крови бактериальный осадок имеет значительное влияние на идентификации и АСТ выполнения заказа и, таким образом, на успешный исход пациентов, страдающих от инфекций кровотока.
Introduction
Инфекций кровотока и сепсис у госпитализированных пациентов являются основной причиной заболеваемости и смертности. Таким образом, смертность от инфекций кровотока наблюдается примерно в 14% до 37% госпитализированных пациента и может увеличиться до 35% в отделениях интенсивной терапии пациентов 1-3. Быстрое выявление инфекционного агента является ключевым для руководства оптимальное антимикробной терапии и увеличить успешный исход антимикробной 4,5 терапии. Экспресс-анализ по Граму от положительной культуры крови уже имеет значительное влияние на адаптацию антимикробной терапии 6,7, но точной идентификации инфекционного агента требуется обеспечить лучший адаптированный лечения антибиотиками для пациентов. Например, различные схемы лечения антибиотиками должны быть реализованы следующие бактериемии с энтерококков и стрептококков, которые трудно отличить от окрашивания Грама. Аналогично, идентификация на видовом ЛевEL требуется для обнаружения грамотрицательных энтеробактерий, кодирующий хромосомной AMPC ген, сообщающий повышенную устойчивость к β-лактамы 8.
С положительной культуры крови, обычный диагностический подход является субкультура инфекционного агента на разных чашках с агаром, который требует несколько часов дополнительного инкубационного предварительного идентификации с различными подходами в том числе биохимических тестов, роста на различных селективных средах и автоматизированных систем микробной идентификации. Время результатам обычного диагностического подхода является то, приблизительно от 1 до 3 дней.
Появление технологии матрица-лазерной десорбцией / ионизацией время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF) для быстрой идентификации микроорганизмов предоставил новый инструмент для быстрого выявления микроорганизмов из колоний, выросших на чашках с агаром, но и непосредственно от положительной крови культуры (рис 1) 9-12. Чтэ использование MALDI-TOF для идентификации инфекционного агента из крови значительно сократила время к результатам до нескольких минут, а не часы и дни, требуемых традиционными методами. Как обсуждалось Croxatto соавт. 13, эффективность идентификации MALDI-TOF зависит от различных параметров, в том числе чистоты и количества микроорганизма в. Эти два критерия легко получаются из дискретных колоний, выросших на чашках с агаром, но требует предварительной аналитической лечение бактериального обогащения и очистки от сложных образцов, таких как культура крови, которые содержат несколько клеточных и белковых компонентов, которые могут помешать идентификации MALDI-TOF.
Методы изоляции различных микроорганизмов »от культуры крови были использованы в ряде исследований, включая сапонина или другим способом мягкие моющие средства для бактериального извлечения 9,14, метод сыворотки сепаратора 10, лизиса методы центрифугирования 12 </sвверх »и коммерчески решения, такие как комплект sepsityper. Наша бактериологии диагностическая лаборатория разработала простой крови культуры подготовку бактериальный осадок на основе хлорида аммония эритроцитов-лизиса, которые позволяют быстро идентифицировать бактерий и дрожжей по MALDI-TOF и автоматизированных идентификационных систем (Рисунок 2) 15. Этот препарат крови культура окатышей также предоставить образец для других прямых последовательных применений, таких как окрашивание Грама, автоматизированные диагностические тесты, основанные на ПЦР, такие как POCT-ПЦР для быстрого обнаружения метициллин-устойчивый Staphyloccocus стафилококк (MRSA) и чувствительности к антибиотикам с автоматизированные системы АСТ и / или дисковыми диффузии анализов на чашках с агаром (Рисунок 3).
В этой работе мы описываем различные шаги для подготовки крови культуры бактерий крупинки, как объясняется Prod'hom соавт. 15 (Рисунок 4). Мы также деписец протоколы для трех основных приложений, которые могут выполняться на культуры крови пеллет: Идентификация по MALDI-TOF 15, идентификационный (ID) и тестирование чувствительности к антибиотикам (АСТ) с автоматизированными системами 16 для энтеробактерий и стафилококков и автоматизированной ПЦР диагностический тест основан на обнаружении MRSA 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с обычными положительной культуры крови диагностических подходов, быстрое приобретение бактериальной гранулы с помощью аммония хлорида лизиса центрифугирования подход сократить время, чтобы сообщать идентификацию на 16 до 24 часов, и время, чтобы сообщить AST на 24 до 48 часо?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим техников бактериологической лаборатории Университетского больничного центра Лозанны за помощь в реализации методы в лаборатории.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Riferimenti
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
