Framställning av en Blood Culture Pellet för Rapid Bacterial Identifiering och Antibiotikum resistensbestämning
Summary
En snabb bakteriell pellet-beredning från en positiv blododling kan användas som ett prov för tillämpningar såsom identifiering genom MALDI-TOF, Gram-färgning, antibiotiska resistensbestämning och PCR-baserat test. Resultaten kan snabbt kommuniceras till kliniker att förbättra resultatet av patienter som lider av infektioner i blodomloppet.
Abstract
Blodomloppet infektioner och sepsis är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet. Framgången för patienter som lider av bakteriemi är beroende av en snabb identifiering av smittämnet för att vägleda optimal antibiotikabehandling. Analysen av Gram fläckar från positiv blododling kan snabbt genomföras och redan avsevärt påverka antibiotikakur. Men den exakta identifieringen av smittämnet fortfarande krävs för att fastställa den optimala riktad behandling. Vi presenterar här en enkel och snabb bakteriepelleten beredning från en positiv blododling som kan användas som prov för flera viktiga tillämpningar i senare led såsom identifiering av MALDI-TOF MS, antibiotika resistensbestämning (AST) med skiv diffusionsanalys eller automatiserade ASAT system och genom automatiserad PCR-baserad diagnostisk testning. Utförandet av dessa olika identifierings och AST som tillämpas direkt på blododlings bakteriella pellets är mycket siMilar till prestanda som normalt erhålls från isolerade kolonier odlas på agarplattor. Jämfört med konventionella metoder, den snabba förvärv av en bakteriell pellet minskar avsevärt tiden för att rapportera både identifikation och AST. Således kan följa blododling positivitet, identifiering av MALDI-TOF rapporteras inom mindre än 1 timme, medan resultaten från AST genom automatiserade AST system eller skiv diffusionsanalyser inom 8 till 18 timmar, respektive. På samma sätt kan resultatet av en snabb PCR-baserad analys meddelas de kliniker mindre än 2 timmar efter rapporten om en bakteriemi. Tillsammans visar dessa resultat att den snabba beredningen av en blododling bakteriell pellet har en betydande inverkan på identifiering och AST handläggningstid och därmed på det framgångsrika resultatet av patienter som lider av blodinfektioner.
Introduction
Blodomloppet infektioner och sepsis i inlagda patienter är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet. Således är dödligheten relaterad till blodomloppet infektioner observerades hos cirka 14% till 37% av sjukhus patienten och kan öka till 35% på intensivvårdsavdelningar patienter 1-3. Den snabb identifiering av smittämnet är avgörande för att vägleda optimal antimikrobiell behandling och öka framgångsrikt resultat av antimikrobiell behandling 4,5. Den snabba analysen av Gram fläckar från positiv blododling redan har en betydande inverkan på anpassningen av antimikrobiell behandling 6,7 men korrekt identifiering av smittämnet är skyldig att ge den bästa anpassad antibiotikabehandling till patienterna. Till exempel olika antibiotikabehandlingsregimer måste genomföras efter bakteriemi med enterokocker och streptokocker som är svåra att skilja från Gram-färgning. Likaså identifiering på arten Level krävs för att detektera Gramnegativa enterobakterier kodar en kromosomal AmpC gen som ger en ökad resistens mot β-laktamer 8.
Med en positiv blododling, är det konventionella diagnostiska tillvägagångssätt för subkultur smittämnet på olika agarplattor, som kräver flera timmars extra inkubation föregående kartläggning med olika metoder, bland annat biokemiska tester, tillväxt på olika selektiva medier och automatiserade mikrobiell identifieringssystem. Tiden till resultaten av ett konventionellt diagnostiskt tillvägagångssätt är av ca 1 till 3 dagar.
Framväxten av den matris assisterad laser desorption / jonisering time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF)-teknik för snabb identifiering av mikroorganismer har gett ett nytt verktyg för att snabbt identifiera mikroorganismer från kolonier som odlas på agarplattor utan också direkt från positivt blod kulturer (Figur 1) 9-12. The användning av MALDI-TOF för att identifiera ett smittämne från blododlingar har minskat avsevärt tiden till resultat att några minuter istället för timmar och dagar som krävs med traditionella metoder. Såsom diskuteras av Croxatto et al. 13, effektiviteten i MALDI-TOF-identifiering baseras på olika parametrar, inklusive den mikroorganism s renhet och kvantitet. Dessa två kriterier kan lätt erhållas från diskreta kolonier odlas på agarplattor utan krävde en pre-analytiska behandling för bakteriell anrikning och rening från komplexa prover såsom blod kultur, som innehåller multipla cellulära och proteinkomponenter som kan interferera med MALDI-TOF-identifiering.
Olika mikroorganismer "isoleringsmetoder från blododling har använts i ett antal studier, inklusive saponin eller annan milda tvättmedel metod för bakteriell extraktion 9,14, serum separator metod 10, Lysis centrifugemetoder 12 </sup> och kommersiellt lösningar som sepsityper kit. Vår bakteriologi diagnoslaboratorium har utvecklat ett enkelt blod-kultur bakteriepelleten på basis av ammoniumklorid erytrocyt-lys, som tillåter snabb identifiering av bakterier och jäst med MALDI-TOF och automatiserade identifieringssystem (figur 2) 15. Detta blod-kultur pellets preparatet ger också ett prov för andra direkta tillämpningar i senare led såsom Gram färgning, automatiserade PCR-baserade diagnostiska tester såsom POCT-PCR för snabb detektion av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) och antibiotika resistensbestämning med automatiserade ASAT system och / eller från disk diffusionsanalyser på agarplattor (Figur 3).
I detta arbete beskriver vi de olika stegen för framställning av blod-kulturen bakteriepelleten som förklaras av Prod'hom et al. 15 (Figur 4). Vi kommer också att frånskriftlärd protokollen för tre av de viktigaste applikationer som kan utföras på blododling pellets: Identifiering av MALDI-TOF 15, identifiering (ID) och antibiotikaresistensbestämning (AST) med de automatiserade system 16 för Enterobacteriaceae och stafylokocker och automatiserade PCR- baserat diagnostiskt test för påvisande av MRSA 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jämfört med konventionella positiva blododlings diagnostiska metoder, den snabba förvärv av en bakteriell pellets med hjälp av ammoniumklorid lys centrifuge strategi minska tiden för att rapportera identifiering med 16 till 24 timmar och tiden för att rapportera AST från 24 till 48 timmar (figur 1 och 3).
Snabbt införande av lämplig antibiotikabehandling är avgörande för att förbättra resultatet av patienter som lider av blodinfektioner. Således tidig identif…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar de tekniker för bakteriologi laboratorium vid University Hospital Center i Lausanne för deras hjälp att genomföra de tekniker i laboratoriet.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Riferimenti
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
