Isolasjon og kultur av Spaltet sensoriske nevroner Fra Chick embryo

Summary

Cellekultur modellene gir detaljert kontroll over miljøforhold og dermed gi en kraftig plattform for å belyse mange aspekter av nevronale cellebiologi. Vi beskriver en hurtig, billig og pålitelig metode for å isolere, dissosierer, og kultur sensoriske neuroner fra kyllingembryo. Detaljer om grunnen forberedelse og immunocytochemistry tilbys også.

Abstract

Nerveceller er mangefasetterte celler som bærer informasjon avgjørende for en rekke funksjoner, inkludert følelse, motorikk, læring og hukommelse. Studerer nevroner in vivo kan være utfordrende på grunn av sin kompleksitet, sine varierte og dynamiske miljøer, og tekniske begrensninger. Av disse grunner, kan studere nerveceller in vitro være gunstig å løse de komplekse mysterier nevroner. Den godt definerte art cellekulturmodeller gir detaljert kontroll med miljøforhold og variabler. Her beskriver vi hvordan du isolerer, distansere, og kultur primære nerveceller fra kyllingembryo. Denne teknikken er rask, billig, og genererer robustly voksende sensoriske nerveceller. Fremgangsmåten produserer konsekvent kulturer som er sterkt anriket på neuroner og har svært få ikke-neuronale celler (mindre enn 5%). Primære nevroner ikke holder seg godt til ubehandlet glass eller vev kultur plast, derfor detaljerte prosedyrer for å lage to Distinct, er veldefinert laminin-inneholdende substratet for neuronal plette beskrevet. Dyrkede nevroner er svært mottagelig for flere cellulære og molekylære teknikker, inkludert co-immunoprecipitation, levende celle innbiller seg, RNAi, og immunocytochemistry. Prosedyrer for dobbel immunocytochemistry på følgende dyrkede nerveceller har blitt optimalisert og beskrevet her.

Introduction

Neuroner er komplekse celler som bærer informasjon som er viktig for en rekke funksjoner, inkludert følelse, syn, motorbevegelse, læring og hukommelse. Unike fra andre celletyper, neuroner strekker arm-lignende prosesser, kalt axoner, for å danne nødvendige nevrale motorveier for kommunikasjon. Under utvikling spesialisert avdelinger plassert på tuppen av voksende axoner, kalt vekst kjegler, navigere gjennom en konsert av ekstracellulære signaler for å lede axon til dens passende destinasjon. Den intrikate molekylære mekanismene som ligger bak veksten kjegle navigasjon er ikke fullt ut forstått. For bedre å forstå disse mekanismene, har etterforskerne brukt cellekultur modeller for å studere nervecellene i et definert og forenklet in vitro miljø. Studerer nevroner i kultur ^en har ført til betydelige fremskritt i vår forståelse av nervecellebiologi inkludert: neuronal differensiering ^2, cytoskeletal dynamikk, endocytose og trafficking, Dendrittregulering ^3,4, aksonal regenerasjon ^5, og kliniske tilstander som neuropathies ^seks. I tillegg, dyrkede neuroner er svært mottagelig for et bredt spekter av forskning teknikker inkludert immunocytokjemi, celleoverflate co-immunoutfelling, Western blot, transfeksjon, RNAi, og direkte avbildning slik som timelapse analyse av vekst kjegle motilitet. Således dyrkning primære neuroner er en kraftig metode for å belyse en rekke sider ved cellebiologi av neuroner.

Cellekulturmodell gir etterforskere med detaljert kontroll over miljøforhold og variabler. For eksempel kan substratet på hvilke neuroner er belagt (og vokse over) lett manipuleres. Her vi gi detaljerte instruksjoner for å generere to forskjellige substrater, en med lav laminin-1-konsentrasjon, og den andre med mettende konsentrasjoner av laminin-1. Overraskende, kan forskjellige konsentrasjoner av det samme molekylet har dramatiske effekterpå den interne tilstand av nerveceller, så vel som deres celleoverflate sammensetning. For eksempel, intracellulære nivåer av cAMP og overflate nivåer av inte er vesentlig forskjellige i nevroner belagt på disse to grunnen ^7,8. Ytterligere studier har vist at andre molekyler, inkludert fibronektin og chondroitin sulfat proteoglykaner, påvirker ekspresjonen av celleoverflatemolekyler og neuronal motilitet ^7-11. I tillegg er løselige molekyler som neurotrophins og neurotropins også påvirke cellemembranen sammensetning og neuronal motilitet ^12-16 og kan lett og nøyaktig manipuleres i en cellekulturmodell.

Her beskriver vi metoder for å isolere og kultur dissociated sensoriske nerveceller fra kyllingembryo. Denne prosedyren har blitt brukt til å gjøre betydelige gjennombrudd i nevrobiologi, inkludert axon utvekst ^{5,7,8,10,11,16-21} og ble endret fra en prosedyre utviklet for å isolere ganglion celler ^22. Det finnesflere fordeler med denne tilnærmingen. Først er mange funksjoner i chick rygg rotganglion (DRG) utvikling godt karakterisert inkludert tidsramme for fødselen, axon forlengelse, og protein uttrykk profiler ^2,23-28, og dermed gi en instruktiv grunnlaget for å bygge informativ in vitro eksperimenter. For det andre, dissosiert neuronale kulturer tillate undersøkeren til mer direkte å studere neuroner sammenlignet med alternative metoder ved bruk av intakte DRG-eksplantater (som inneholder neuroner og ikke-neuronale celler) og / eller blandede kulturer inneholdende både dissosiert nevroner og ikke-nevronale celler. Tredje, den prosedyren som er beskrevet her er enkel, billig og mottagelig for studenter. Derfor kan denne teknikken brukes til forskning, så vel som for undervisningsformål. Videre bør mindre variasjoner av denne protokollen tillater rask, høy avkastning rensing av nerveceller fra andre enn DRGs kilder. For eksempel kan denne prosedyren bli endret for å gi neuronally enriched kulturer fra andre vev slik som embryonisk forhjerne eller ryggmargen.

Immunocytochemistry protokoller har blitt optimalisert for disse dissociated nevrale kulturer og er beskrevet i detalj her. Fremgangsmåten for dobbelt immunocytokjemi mot neural celleadhesjonsmolekyl (NCAM) og β1 integriner er gitt. Data som genereres fra disse immuncytokjemisk metoder har blitt brukt til å undersøke den romlige mønster og intensitet av flere molekyler i dyrkede nerveceller ^8,16.

Protocol

1. Cover Forberedelse: Acid Wash og Bake Minst to dager før disseksjon (trinn 2), begynner de følgende skritt for å forberede Dekk. Utfør syre vasketrinn for å fjerne oljer og grundig rene dekkglass. Belastningsdekk i porselen holder som vertikalt posisjonerer Dekk og hindrer dem fra å berøre hverandre. Senk holderen og dekkglass i glass histologi beholder fylt med 2 M saltsyre (HCl). Alternativt, hvis porselen innehaveren ikke er tilgjengelig, spre ~ 20 Dekk horisontalt for å dekke bunnen p…

Representative Results

Protokollen er beskrevet her gjør etterforskere til kultur en beriket befolkning på dissociated embryonale sensoriske nevroner med svært få (f.eks <5%) ikke-nevronale celler 7,8,10,16. Mange DRGs kan fås fra lumbosacral, thorax og cervical regioner. Avhengig av behovene til etterforsker, kan DRGs fra disse forskjellige anatomiske regioner være lett isolert. For eksempel, Figur 1 viser bilder av kylling embryo gjennom ulike stadier av disseksjon med lende DRGs uthevet i <stro…

Discussion

Her presenterer vi detaljerte protokoller for isolering og dyrking dissociated sensoriske nerveceller fra en kylling embryo. Denne prosedyren genererer en beriket befolkning på robust voksende nevroner in vitro ^7,8,10,16. Mange cellulære og molekylære teknikker kan anvendes på disse dyrkede nevroner, inkludert immunocytokjemi, som er beskrevet her. Denne protokollen ble nylig brukt til kvantitativt vurdere intensiteten av immunolabeled aktivert inte i sensoriske vekst kjegler ^8,16. I d…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036