Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Sommario

Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica.

Abstract

I neuroni sono cellule poliedriche che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Studiare i neuroni in vivo può essere difficile a causa della loro complessità, i loro ambienti diversi e dinamici, e limitazioni tecniche. Per queste ragioni, studiando i neuroni in vitro può rivelarsi utile per svelare i complessi misteri di neuroni. Il carattere ben definito di modelli di coltura cellulare fornisce un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Qui si descrive come isolare, dissociare, e la cultura neuroni primari di embrioni di pollo. Questa tecnica è rapido, poco costoso, e genera robusta crescita neuroni sensoriali. La procedura produce costantemente le culture che sono altamente arricchito per i neuroni e ha pochissime cellule non neuronali (meno del 5%). Neuroni primari non aderiscono bene al vetro non trattato o di un tessuto culturale di plastica, quindi le procedure dettagliate per la creazione di due distinct, ben definito substrati-laminina contenente per la placcatura neuronale sono descritti. Neuroni in coltura sono altamente suscettibili di molteplici tecniche cellulari e molecolari, tra cui co-immunoprecipitazione, immaginare cellule vive, RNAi, e immunocitochimica. Procedure per doppia immunocitochimica su questi neuroni in coltura sono state ottimizzate e qui descritto.

Introduzione

I neuroni sono cellule complesse che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, visione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Unico da altri tipi di cellule, i neuroni si estendono i processi braccio-come, chiamate assoni, per formare autostrade neurali essenziali per la comunicazione. Durante lo sviluppo specializzata vani situati alle estremità degli assoni in crescita, chiamati coni di crescita, navigare attraverso un concerto di segnali extracellulari per condurre l'assone alla sua destinazione appropriata. I meccanismi molecolari complessi che sono alla base della crescita del cono di navigazione....

Protocollo

1 Coverslip Preparazione: lavaggio acido e Bake

1. Almeno 2 giorni prima della dissezione (punto 2), iniziare la seguente procedura per preparare vetrini. Eseguire la fase di lavaggio acido per rimuovere oli e coprioggetto accuratamente puliti.
2. Coprioggetto carico di titolare di porcellana che posiziona verticalmente coprioggetto e impedisce loro di toccarsi. Immergere porta e coprioggetto in un contenitore di vetro riempito con istologia 2 M di acido cloridrico (HCl). In alternativa, se titolare di porcellana non è disponibile, si sviluppa ~ 20 coprioggetto orizzontalmente per coprire il fondo di 100 mm vetro piastra di Petri e immergere copriogget....

Risultati

Il protocollo qui descritto consente agli investigatori di cultura una popolazione arricchita di dissociate neuroni sensoriali embrionali con pochissime cellule (ad esempio, <5%) non neuronali ^7,8,10,16. Numerosi DRG possono essere ottenuti dal lombosacrale, toracica e cervicale. A seconda delle esigenze del ricercatore, DRG di queste regioni anatomiche distinte possono essere facilmente isolate. Ad esempio, la figura 1 mostra le immagini del embrione di pollo attraverso varie fas.......

Discussione

Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento e la coltura dissociati neuroni sensoriali provenienti da un embrione di pulcino. Questa procedura genera una popolazione arricchita di neuroni robusta crescita in vitro ^7,8,10,16. Numerose tecniche cellulari e molecolari possono essere applicati a questi neuroni in coltura, compreso immunocitochimica, descritto qui. Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per valutare quantitativamente l'intensità delle integrine attivate i.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre sterili per piccole colture (35 mm)	Corning	430165
Piastre sterili per colture grandi (100 mm)	Falcon	353003
Piastre sterili per Petri grandi (100 mm)	VWR	89000-302
Piastra per Petri in vetro (100 mm)	VWR	D108962
Fine Pinze	Fine Science Tools	11251-10
Pinze standard	scienze fini	1100-12
Vetrini coprioggetti (22 x 22 mm)	Fisher	12 518 105K	0,13-0,17 mm lo spessore è ottimale per la microscopia
Porta vetrino coprioggetti	in porcellana Thomas scientific	8542E40
Siero fetale bovino	Gibco	17502-048	utilizzare 50 ml di aliquote per 500 ml di terreno F12
di prosciutto HCl	VWR	VW3204-1	utilizzare a 2 M, può essere utilizzato due volte prima di scartare
NaCl	Sigma	S9888	utilizzare 5 M di soluzione NaCl per laminina-1 soluzione madre
Laminin-1	Invitrogen	23017-015	Aggiungere 72 &; l di 5 M NaCl sterile e aliquote in 50 µ l
15 ml Tubo conico	per il trattamento delle cellule	229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	usato a 1x, diluire con acqua filtrata sterile Millipore
PBS 10x	Gibco	14080	usato a 1x, diluire con acqua filtrata sterile Millipore
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetale Siero Bovino Albumina (BSA)	Gibco	10438	utilizzare in F12HS20 al 10%
HEPES	Sigma	H3375	rendere sterile la soluzione 1 M in acqua distillata, diluire in terreno F12 per ottenere la concentrazione finale di 10 mM
Penicillina/streptomiocina	Sigma	P0781	utilizzare 5 ml in 500 ml di terreno F12
NT3	Millipore	GF031	Aggiungere 1 ml di acqua sterile di Millipore, aliquotare in condizioni sterili, conservare a -20 gradi C, utilizzare alla concentrazione finale di 10 ng/ml in mezzi F12H, mantenere in -20 gradi C congelatore senza sbrinamento
NGF	RnD systems	256-GF	Aggiungere 1 ml di 1x PBS sterile con 0,1% BSA, aliquotare in condizioni sterili, conservare a -20 ° C, utilizzato alla concentrazione finale di 10 ng/ml in F12H media
L-Glutammina	Sigma	G7513	aliquota in condizioni sterili, conservare a -20 ° C, utilizzare alla concentrazione finale di 200 mM in terreno F12H
Tripsina	Sigma	T4049	aliquota in condizioni sterili, conservare a -20 ° C
Albumina sierica bovina (BSA)	Gibco	15260
Altri elementi necessari: strumenti di dissezione generale, comprese pipette di vetro Pasteur, uova di gallina livornese bianca fertile, incubatrice per uova di controllo (umidificata, 37 ° C), camera di incubazione cellulare (umidificata, 37 ° C), cappa a flusso laminare, visione binoculare stereoscopica scope
Tabella dei reagenti di immunocitochimica
Saccarosio	Sigma	S9378	utilizzato in soluzione fissativa (4% paraformaldeide, 30% saccarosio, 2x PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldeide	Sigma	P6148	utilizzato in soluzione fissativa (4% paraformaldehye, 30% saccarosio, 2x PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Siero di capra normale	Life technologies	PCN500
Vetrini per microscopio	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	policlonal
Antibody against attivato e beta; 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Secondary Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036

Strumenti per le