Выделение и культуры диссоциированных сенсорные нейроны От куриные эмбрионы

Summary

Модели клеточной культуры обеспечивают детальный контроль над условиями окружающей среды и таким образом предоставляют мощную платформу для выяснения многочисленные аспекты нейронов клеточной биологии. Мы описываем быстрый, недорогой и надежный способ, чтобы изолировать, диссоциации и культуры сенсорных нейронов от куриных эмбрионов. Подробная информация о подготовке субстратов и иммуноцитохимии также предоставляются.

Abstract

Нейроны являются многогранные клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, движения двигателя, обучения и памяти. Изучение нейронов в естественных условиях может быть сложной задачей в связи с их сложностью, их многообразной и динамичной среде, и технических ограничений. По этим причинам, изучая нейроны в пробирке может оказаться полезным, чтобы разгадать сложные загадки нейронов. Четко определены характер моделей клеточных культур обеспечивает детальный контроль над условиями окружающей среды и переменных. Здесь мы опишем, как изолировать, отделить, и культура первичные нейроны от куриных эмбрионов. Этот метод является быстрым, недорогим, и генерирует энергично растет сенсорных нейронов. Процедура последовательно производит культур, которые высоко обогащенные для нейронов и имеет очень мало, не нервных клеток (менее 5%). Первичные нейроны не хорошо прилипать к необработанной стекла или культуры ткани пластика, поэтому подробные процедуры для создания двух DistinКТ, четко определенные ламинином содержащих субстраты для нейронов обшивки описаны. Искусственный нейроны являются весьма поддаются нескольких клеточных и молекулярных методов, в том числе со-иммунопреципитацией, живой воображения клеток, РНК-интерференции, и иммуноцитохимии. Процедуры двойного иммуноцитохимии на этих культивируемых нейронов были оптимизированы и описано здесь.

Introduction

Нейроны являются сложными клетки, которые несут информацию, необходимую для выполнения различных функций, включая ощущения, зрение, движения двигателя, обучения и памяти. Уникальная от других типов клеток, нейронов расширить рук, как процессы, называемые аксоны, чтобы сформировать основные нервные дороги для связи. Во время развития специализируется отсеков, расположенных на кончиках растущих аксонов, называется конусы роста, перемещаться по концерта внеклеточных сигналов, чтобы привести аксон к ее соответствующему назначению. Сложные молекулярные механизмы, лежащие в основе роста конус навигацию, полностью не поняты. Чтобы лучше понять эти механизмы, исследователи использовали модели клеточной культуры для изучения нейронов в определенной и упрощенной в пробирке среды. Изучение нейронов в культуре ¹ привело к значительному прогрессу в нашем понимании нейронов клеточной биологии, включая: дифференцировки нейронов ^2, цитоскелета динамики, эндоцитоза и торговли, дендритоврегулирование ^3,4, регенерацию аксонов ^5, и клинические состояния, такие как невропатии ^6. Кроме того, культивируемые нейроны являются весьма пригодны для широкого спектра методов исследования, включая иммуноцитохимии, клеточной поверхности ко-иммунопреципитации, Вестерн-блоттинга, трансфекции, RNAi, и живого изображения, такие как TimeLapse анализа конуса роста подвижности. Таким образом, культивирование первичных нейронов является мощным подход к выяснению многочисленные аспекты клеточной биологии нейронов.

Модель культуры клеток обеспечивает следователям подробного контроля над условиями окружающей среды и переменных. Например, субстрат, на котором нейроны покрытием (и расти на) можно легко манипулировать. Здесь мы предоставляем подробные инструкции для генерации две различные субстраты, один с низкой концентрацией ламинином-1, а другой с насыщающих концентраций ламинином-1. Удивительно, различные концентрации и той же молекулы может иметь драматические последствияот внутреннего состояния нейронов, а также их клеточной поверхности композиции. Например, внутриклеточные уровни цАМФ и поверхностных уровнях интегринов значительно отличаются в нейронах посеянных на этих двух субстратов ^7,8. Дополнительные исследования показали, что другие молекулы, в том числе фибронектина и хондроитинсульфата протеогликаны, воздействия на экспрессию молекул клеточной поверхности и нейронов моторики ^7-11. Кроме того, растворимые молекулы, такие как нейротропинов и neurotropins также влияют на состав клеточной мембраны нейронов и моторику ^12-16 и может быть легко и точно управлять в модели культуры клеток.

Здесь мы опишем методы, чтобы изолировать и культуры диссоциированных сенсорные нейроны от куриных эмбрионов. Эта процедура была использована, чтобы сделать значительные прорывы в области нейробиологии, в том числе аксонов ^{5,7,8,10,11,16-21} и был изменен с процедурой для изоляции ганглиозных клеток ^22. Естьнесколько преимуществ такого подхода. Во-первых, многие черты цыплят спинномозговых ганглиев (DRG) развития хорошо охарактеризованы в том числе сроков рождения, расширение аксона, и экспрессия белка анкеты ^2,23-28, обеспечивая тем самым поучительный основу, на которой строится информативным в пробирке эксперименты. Во-вторых, диссоциированных нейронов культуры позволяют исследователю более непосредственно изучать нейронов по сравнению с альтернативными подходами с использованием интактных DRG эксплантов (которые содержат нейроны и не-нейрональных клеток) и / или смешанных культур, содержащие оба диссоциированных нейронов и не-нейрональных клетках. В-третьих, процедура, описанная здесь проста, недорогой и поддаются студентов. Таким образом, эта методика может быть использована для исследований, а также в учебных целях. Кроме того, незначительные вариации этого протокола должны предоставлять очистку быстро, с высоким выходом нейронов от других, чем ДРГ источников. Например, эта процедура может быть изменен, чтобы обеспечить нейронально ENRiched культуры из других тканей, таких как эмбрионального переднего мозга или спинного мозга.

Протоколы Иммуноцитохимическая были оптимизированы для этих диссоциированных нейронов культур и подробно описаны здесь. Процедура двойного иммуноцитохимии против нейронной молекулы клеточной адгезии (NCAM) и β1 интегринов предоставляется. Данные, полученные от этих иммуноцитохимических методы были использованы для изучения пространственной кучность и интенсивность нескольких молекул в культивируемых нейронов ^8,16.

Protocol

1 Покровные Приготовление: Acid Wash и Выпекайте По крайней мере, за 2 дня до вскрытия (шаг 2), начать следующие шаги по подготовке покровные. Выполните кислоты шаг раствором, чтобы удалить масла и тщательно мойте покровные. Загрузка покровные в держателе фарфора, что вертикально п?…

Representative Results

Протокол, описанный здесь позволяет следователям культуры обогащенный население диссоциированных эмбриональных сенсорных нейронов с очень немногих (например, <5%) не-нервных клеток 7,8,10,16. Многочисленные DRGs могут быть получены из пояснично-крестцового отдела, грудного и ше…

Discussion

Здесь мы представляем подробные протоколы для выделения и культивирования диссоциирован сенсорные нейроны от куриного эмбриона. Эта процедура создает обогащенный население энергично растущих нейронов в пробирке ^7,8,10,16. Многочисленные клеточные и молекулярные методы могу?…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036