Конформационный Оценка ВИЧ-1 тримерных гликопротеинов с помощью мобильного основе ELISA Пробирной
Summary
Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
Abstract
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Introduction
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) запись, при посредничестве тримерных вирусных гликопротеинами оболочки (ENV) является первым шагом инфекционного цикла. Будучи единственным подвергается вирусный антиген, представленный на поверхности вирионов, окр тример вызывает нейтрализации и nonneutralizing антитела. Как таковая, она представляет собой интересный кандидат на дизайн вакцина иммуногена. Тем не менее, испытания вакцинации с Env в растворимых или рекомбинантных форм были получены ответы лишь с минимальным эффективности против самых первичной ВИЧ-1 изолятов 1-3. Тем не менее, частичное эффективность наблюдается в возобновление интереса к ВИЧ-1 Env качестве кандидата иммуногена испытание вакцины RV144 4. Это было подтверждено результатами недавнего исследования, описывающего, что вакцин вызвали анти-Env антитела были достаточно для создания определенную степень защиты от SIV и ВИЧ бросает вызов 5.
После синтезированного в эндоплазматической сети, в glycoprote Envв предшественника, gp160, подвергается различным пост-трансляционных модификаций, которые имеют решающее значение для способности к топливу вирусную процесс сварки. Конверты предшественник должен сложить правильно и юрист тримеров перед расщепляется на его экстра-цитоплазматических gp120 и трансмембранный gp41 субъединиц 6-10, с нековалентных взаимодействий, поддерживая связь gp120-gp41. Инфицированная клетка техника также несет ответственность за сильно гликозилирующих Env, включающий около 50% от общей массы 11,12. В результате сложная структура позволяет окружающая среда, чтобы быть конформационно гибкой 13,14, обеспечивая при этом метастабильность, что, как полагают, позволит Конверты для адаптации и скрыть определенные высоко иммуногенные эпитопы, которые иначе могут быть доступны 15-19, подчеркнув важность, чтобы лучше понять различные конформации отбираются посредством родного Env тримера.
На сегодняшний день, несколько методов были разработаны и успешно используются для изучения Env конформационную глфланцев. Тем не менее, они различаются по их ограничений, которые часто ограничиваются конкретным условиям окр. Например, поверхностный плазмонный резонанс или иммунопреципитации с использованием конформационных специфических моноклональных антител (моноклональные антитела), опираются либо на мономерных растворимых или растворенных молекул Env, которые, как известно, иммуногенетически отличается от их тримерных форм 20,21. Недавние исследования также показывают, что расщепление влияет Env конформации в результате в экспозиции эпитопов в основном, признанных nonneutralizing антитела 14,22,23.
Здесь мы подробно описать метод, который позволяет для быстрого и легкого определения конформации клеточно-выразил Env тримеров 18,24-26. После кратковременной трансфекции в Env в линии клеток человека адгезивного связывания ENV-специфических антител обнаруживается с помощью простой реакции хемилюминесценции. Этот метод также может быть использован для описания конформационной предпочтение конформации-висимостьдент антитела. Таким образом, этот препарат обеспечивает надежную и очень гибкий метод обнаружения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот анализ оптимизирован для обнаружения взаимодействие конкретных моноклональных антител ВИЧ-1 тримерного Env экспрессируется на поверхности клетки. После того, как протокол был создан, он может быть использован в среде с высокой производительностью с низким общим материальных затр…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Джеймс Робинсон за его щедрый дар A32, 17b, 48d, и C11 МКА. ПГТ 121 был получен посредством Программы NIH СПИДа реагента, Отдел СПИДа, NIAID, NIH (Cat # 12343). Эта работа была поддержана Канада фонда инновационного лидера Программа # 29866, на CIHR операционной # 257792, по FRQS создании Young Scientist предоставить # 24639 к AF и по CRCHUM континуума гранта, а также с помощью CIHR катализатора гранта # 126630 на АФ и MR. AF является получателем FRSQ Chercheur Boursier юниоров 1 стипендий # 24639. М.В. поддержали CIHR Диссертационные исследования Award # 291485.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
Riferimenti
- Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
- Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
- Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
- Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
- Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
- Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
- Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
- Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
- Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
- Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
- Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
- Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
- Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
- Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
- Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
- Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
- Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
- Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
- Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
- Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
- Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
- Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
- Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
- Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
- Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
- Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
- Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
- Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
- Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
- Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
- Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
- Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
- Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
- Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
- Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
- Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
- Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).
