JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Published: September 14, 2014
doi:
10.3791/51995
, , , , , ,
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology,Université de Montréal

Summary

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Abstract

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Introduction

Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1)-Eintrag, der trimeren viralen Hüll-Glykoproteine ​​(env) vermittelten ist der erste Schritt des Infektionszyklus. Die einzige Virusantigen exponiert an der Oberfläche des Virions präsentiert, löst das Env-Trimer neutralisierende und nichtneutralisierenden Antikörpern. Als solches stellt es einen interessanten Kandidaten für Impfstoff-Immunogen-Design. Allerdings Impfung Studien mit Env in löslicher oder rekombinanten Formen hervorgerufen Antworten mit nur minimaler Wirkung gegen die meisten primären HIV-1-Isolate 1-3. Dennoch Teil Wirksamkeit bei der RV144-Impfstoff-Studie 4 erneutes Interesse an HIV-1 Env als Immunogen Kandidaten beobachtet. Dies wurde durch eine neuere Studie beschreibt die Impfung ausgelöste Anti Env-Antikörpern waren ausreichend, um einen gewissen Schutz gegen SIV und HIV erzeugen Herausforderungen 5 bestätigt.

Nachdem sie im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert, das Env glycoprotein Vorläufers gp160, läuft verschiedene post-translationale Modifikationen, die entscheidend für seine Fähigkeit, das virale Fusionsprozess Brennstoff. Die Env-Vorläufer muss ordnungsgemäß und Associate in Trimeren falten, bevor er in seine extra-zytoplasmatische gp120 und gp41 Transmembranuntereinheiten 6-10 gespalten, mit nicht-kovalente Wechselwirkungen Aufrechterhaltung des gp120-gp41 Liaison. Die infizierten Zellmaschinerie ist auch für stark Glykosylierung Env, umfassend etwa 50% seiner Gesamtmasse 11,12 verantwortlich. Die daraus resultierende komplexe Struktur ermöglicht Env zu konformativ flexible 13,14 sein, während eine Metastabilität, die gedacht wird, damit Env, sich anzupassen und bestimmte hoch immunogene Epitope, die sonst ausgesetzt wäre 15-19 verstecken, was die Bedeutung, die verschiedenen Konformationen besser zu verstehen von der einheimischen Env Trimer abgetastet.

Bisher wurden verschiedene Techniken entwickelt und erfolgreich eingesetzt, um Env Konformationsänderung CH studierenanges. Allerdings unterscheiden sie sich in ihren Grenzen, wobei oft auf spezifische Kontexte Env beschränkt. Zum Beispiel, Oberflächenplasmonresonanz oder Immunpräzipitationstests Verwendung Konformation spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb), beruhen entweder auf monomeren löslichen oder gelösten Moleküle Env, die bekannt sind immungene anders als ihre trimeren Formen 20,21 sein. Neuere Studien legen nahe, dass die Spaltung auch beeinflusst Env Konformationen was die Exposition von Epitopen hauptsächlich von nichtneutralisierenden Antikörpern erkannt 14,22,23.

Hier beschreiben wir ausführlich eine Methode, die für schnelle und einfache Bestimmung der Konformation von zellulär-Env-Trimere 18,24-26 ausgedrückt ermöglicht. Nach transienter Transfektion von Env in einem menschlichen adhärenten Zelllinie die Bindung von Env-spezifische Antikörper wird mit einem einfachen Chemilumineszenzreaktion nachgewiesen. Diese Technik kann auch verwendet werden, um die bevorzugte Konformation des charakterisieren konformationsabhängiger DEPENdent Antikörper. Somit stellt dieser Test ein robustes und hoch flexibel Nachweisverfahren.

Protocol

1. Tag 1 – Cell Culture Platte 2 × 10 4 menschliche Osteosarkom (HOS)-Zellen pro Vertiefung in einer lichtundurchlässigen, 96-Well-Zellkulturplatte für Lumineszenz Lesen. Verwenden Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin ergänzt. Inkubieren bis zum nächsten Tag bei 37 ° C, 5% CO 2. 2. Tag 2 – Polyethylenimin (PEI) Transfektion Vorbereitung Transfektionsgemisch nach…

Representative Results

Unter Verwendung der oben beschriebenen allgemeinen Verfahren, passen wir das Protokoll, um die Auswirkungen von löslichen CD4 (sCD4) und coexprimierten zellulären CD4 über die Exposition der CD4i Epitope auf entweder Wildtyp (wt) oder mutierten Env zu testen, wie zuvor beschrieben, 18,24, 25,28. Abbildung 1 Die allgemeine Verfahren und die Exposition von CD4i Epitope nach der Behandlung mit sCD4 oder durch Co-Expression von zellulären CD4 18 schematisch. In 2 …

Discussion

Dieser Assay ist optimiert, um die Wechselwirkung von spezifischen mAbs mit HIV-1 Env trimere exprimiert auf der Zelloberfläche erkennen. Sobald das Protokoll festgelegt wurde, kann es bei mittleren bis hohen Durchsatz bei geringen Gesamtmaterialkosten und geringe Mengen von Antikörpern verwendet werden. Da dieser Test ist Transfektion basiert, kann es leicht zur Koexpression der zellulären Proteine ​​wie CD4, um ihre Auswirkungen auf die Konformation Env studieren angepasst werden.

J…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Herrn Dr. James Robinson für seine großzügige Geschenk der A32, 17b, 48d und C11 mAb. PGT 121 wurde durch die NIH AIDS Reagenz-Programm, Abteilung für AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343) erhalten. Diese Arbeit wurde von einer Kanada-Stiftung für Innovation Programmleiter # 29866, die von einem Betriebs CIHR # 257792, von einem FRQS Gründung der Young Scientist gewähren # 24639 auf AF und von einem Kontinuum CRCHUM Zuschuss sowie durch einen Katalysator CIHR Grant # 126630 AF und MR. AF ist der Empfänger einer FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 Stipendium # 24639. MV wurde von einer CIHR Doctoral Research Award # 291485 unterstützt.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
HOS cells ATCC CRL-1543
White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom BD 353296
Polyethylenimine, linear, 25000 MW Polysciences 23966 Prepared in 1mg/ml solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium Invitrogen 11995
Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated Pierce 31413
Enhanced Chemiluminescence Substrate PerkinElmer NEL105001EA
TriStar LB 941, Plate Reader Berthold Technologies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Tags

HIV-1Envelope GlycoproteinsConformational ChangesCell-based ELISATrimeric EnvAntibody RecognitionScreeningVaccine Strategies

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Veillette, M., Coutu, M., Richard, J., Batraville, L., Désormeaux, A., Roger, M., Finzi, A. Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay. J. Vis. Exp. (91), e51995, doi:10.3791/51995 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image