מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים
Summary
תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר אלרגן.
Abstract
תגובות אלרגיות הן התוצאה של הפעלת תאי מאסט ובזופילים, ואת שחרורו הבא של vasoactive ומתווכים מעודדי דלקת. חשיפה לאלרגן באדם רגיש יכולה לגרום לתסמינים קליניים המשתנים מאריתמה הקטין לאנפילקסיס סכנת חיים. במעבדה, מודלים של בעלי חיים שונים פותחו כדי להבין את מנגנוני נהיגה תגובות אלרגיות. בזאת, אנו מתארים שיטה מפורטת למדידת שינויים בחדירות כלי דם לכמת תגובות אלרגיות מקומיות. Assay אנפילקסיס המקומי דווח לראשונה ב1920s, והותאם מהטכניקה שפורסמה על ידי אל Kojima et. ב2007 1. ב assay זה, עכברים רגישים לOVA מאותגרים באוזן השמאל עם רכב ובאוזן ימין עם OVA. זה ואחריו הזרקה תוך ורידית של צבע אוונס הכחול. עשר דקות לאחר הזרקת אוונס הכחול, בעלי החיים הוא מורדמים והצבע שextravasated בלאוזניים מופק לילה בפוראמיד. הספיגה של הצבע שחולץ לאחר מכן לכמת עם ספקטרופוטומטר. שיטה זו באופן מהימן תוצאות בביטוי חזותי וכימות של תגובה אלרגית מקומית.
Introduction
סוג אני רגישות יתר מתווך על ידי-Induced אנטיגן cross-linking של IgE על פני השטח של תא פיטום ובזופילים. התוצאה היא degranulation הסלולרי והשחרור של מתווכי vasoactive ומעודדים דלקת כגון היסטמין, tryptase, וגורם 2 שמפעיל את טסיות דם. בעקבות השחרור של מתווכים, מעוצב מראש, במהלך degranulation, תאי פיטום לסנתז ולשחרר פרוסטגלנדינים ולאוקוטריאנים, המגדיל את חדירות כלי דם 3 נוסף. התגובה הקלינית הראשונית מתרחשת במהירות, והוא מכונה "תגובה מיידית". בעור, תגובת wheal ו- התלקחות גלויה בקלות בתוך דקות של אתגר אנטיגן. בהתאם למינון של האתגר, אפשר לצפות "תגובת שלב מאוחר" כמה שעות מאוחר יותר. נפיחות שלב המאוחרות בשל בצקת מקומית וגיוס ליקוציט לתוך הרקמות 2. היסטמין, בדרך כלל נחשב למתווך העיקרי לוקח חלק בתגובות אלרגיות מיידיות, פועלת על קולטן היסטמין 1 (HR1) הביעה בכלי וקולט היסטמין 2 (HR2) הביע על שריר חלק. ההשפעה המשולבת מגבירה את זרימת דם וחדירות כלי דם באתר של דלקת 4.
מגוון רחב של מודלים של בעלי החיים של אלרגיה פותחו כדי לחקור את המנגנונים מעורבים בדלקת אלרגית, כולל מודלים של אסתמה אלרגית, אנפילקסיס המערכתי, ואנפילקסיס המקומי. ממשל צבע תוך ורידים נעשה שימוש כדי למדוד את התגובות אלרגיות מקומיות במודלים של בעלי חיים לכמעט מאה שנה, עם פרסומים המתארים היכרויות טכניקה זו חזרה ל1920s 5. ארנבות ושרקנים היו המודלים של בעלי החיים הראשונים משמשים לבדיקת תגובות של רגישות יתר מיידיות, והתגובות רגישות ביותר נמצאו בדרך כלל באוזן 5,6. Assay מאוחר יותר תוקף לשימוש בחולדות ועכברים 7 8.
מבחינה הסטורית,מגוון של שיטות ניסיוניות היה בשימוש, כולל הזרקה של אנטיגן לפני הזריקה של צבע, הזרקה של צבע לפני הזריקה של אנטיגן, והזרקה בו זמנית של צבע ואנטיגן. ממשל צבע תוך ורידים כאמצעי למדידת תגובות אלרגיות הוא assay צדדי כפי שהוא יכול לשמש למדידה פעילה, פסיבי, ולהפוך את תגובות פסיביות 5,9. צבעים רבים כבר נוצלו כדי להעריך את תגובות אלרגיות, כולל Trypan הכחול, Pontamine שמיים כחולים, אוונס הכחול, Geigy הכחול 536, והודו דיו 5,6,9. פתרון של .0.5% כחול אוואנס הוא כיום הצבע הסטנדרטי המשמש למדידת תגובות אלרגיות בעור.
התגובה אנפילקטית לאתגר היא חולפת; הוא הגיע בעוצמה מקסימלית בתוך 10 – 15 דקות של הזרקת צבע, ואין תגובה היא גלויה אם צבע מנוהל יותר מ 30 דקות אחרי האתגר, ללא קשר למינים של בעלי החיים המשמשים 9. כימות של extravasation הצבע הייתה מקוריתly מתקבל על ידי מדידת גודל wheal כפי שצוין על ידי הצבע הכחול 7-9. בנוסף, סעיפים של תאי פיטום degranulated ניתן לכמת על ידי כריתת רקמת עור מהאתר של התגובה וצביעה עם toluidine הכחול 7. degranulation תא פיטום משמש לעתים קרובות כסמן לעורית, תגובות אלרגיות בתיווך IgE, כתאי פיטום הם אוכלוסיית התא המקומית העיקרית המבטאת את הזיקה הגבוהה IgE קולט FcεRI. טכניקות spectrophotometric למדידת extravasation צבע לתוך הרקמות פותחו לאנפילקסיס הפסיבי עורית (PCA) בחולדה 10 ו11 העכבר של 1990.
פרוטוקול assay אנפילקסיס המקומי הבא הותאם מאל Kojima et. 1, ומנצל ovalbumin ביצת עוף (OVA) כאנטיגן ללעורר תגובות אלרגיות. עם זאת, ניתן להשתמש באנטיגנים אחרים מאשר OVA אם תרצה בכך. Assay אז משתמש לצבוע אוונס הכחול לעקוב אחר שינויים בpermeabilit כלי הדםy המתרחשים עקב תורן תא קישור צולב IgE ושחרור היסטמין.
Protocol
Representative Results
Discussion
סמנים רבים של מחלות אלרגיות נמצאים בשימוש כדי להעריך את הכוח של תגובות אלרגיות הבאות אתגר אלרגן, לרבות שינויים ברמות של היסטמין במחזור, ייצור ציטוקינים Th2, וגיוס של תאים לנוזל רונכואלוואולרית בהגדרה של אתגר דרכי הנשימה. בעוד מעקב אחר שינויים בפרמטרים אלה הוא חשוב ללי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Ellen M. Fox for her work regarding this model of local anaphylaxis. This work was supported by the Uniformed Services University of the Health Sciences grant number R073UE.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
Riferimenti
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z. Passive cutaneous anaphylaxis in the mouse. The Journal of Immunology. 81 (4), 355-357 (1958).
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
