Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Summary

As reações alérgicas, caracterizada pela ativação de mastócitos e basófilos, são movidos pela ligação cruzada de IgE e liberação de mediadores pró-inflamatórios. A avaliação quantitativa da resposta alérgica pode ser conseguido através de corante azul de Evans para monitorar alterações na permeabilidade vascular após o desafio alérgeno.

Abstract

As reações alérgicas são o resultado da ativação de células e basófilos mastro, ea posterior liberação dos vasoativas e mediadores pró-inflamatórios. A exposição a um alergénio em um indivíduo sensibilizado pode resultar em sintomas clínicos que variam de menor eritema a vida em risco de anafilaxia. No laboratório, vários modelos animais têm sido desenvolvidos para compreender os mecanismos de condução respostas alérgicas. Aqui, nós descrevemos um método detalhado para medir alterações na permeabilidade vascular quantificar respostas alérgicas localizadas. O ensaio de anafilaxia local, foi relatada pela primeira vez em 1920, e foi adaptado a partir da técnica publicada pela Kojima et al. em 2007 ^1. Neste ensaio, os ratos sensibilizados a OVA são desafiados na orelha esquerda com o veículo e na orelha direita com OVA. Isto é seguido por uma injecção intravenosa de corante azul de Evans. Dez minutos depois da injecção de azul de Evans, o animal é sacrificado e o corante que extravasou empara os ouvidos é extraída durante a noite em formamida. A absorvância do corante extraído é então quantificada com um espectrofotómetro. Este método resulta de forma confiável em uma manifestação visual e quantificável de uma resposta alérgica local.

Introduction

Hipersensibilidade de tipo I é mediada pela induzida por antigénio a ligação cruzada de IgE na superfície dos mastócitos e basófilos. Isso resulta em degranulação celular ea liberação de mediadores vasoativos e pró-inflamatórios como a histamina, triptase e fator ativador de plaquetas ^2. Após a liberação de mediadores pré-formados durante a degranulação, mastócitos sintetizam e liberam prostaglandinas e leucotrienos, que aumentam ainda mais a permeabilidade vascular ^3. A resposta clínica inicial ocorre rapidamente e é referido como uma "reacção imediata". Na pele, uma resposta pápula-e-queima é facilmente visível a poucos minutos do desafio antigênico. Dependendo da dose do desafio, é possível observar uma "resposta de fase tardia" algumas horas mais tarde. Inchaço fase tardia é devido a edema localizado e o recrutamento de leucócitos para os tecidos ^2. A histamina, geralmente considerado como sendo o mediador principal participa nareações alérgicas imediatas, age em receptores de histamina 1 (HR1), expresso em vasos e receptor de histamina 2 (HR2) expressa no músculo liso. O efeito combinado aumenta o fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular no local da inflamação ^4.

Uma variedade de modelos animais de alergia têm sido desenvolvidas a fim de estudar os mecanismos envolvidos na inflamação alérgica, incluindo modelos de asma alérgica, anafilaxia sistémica e choque anafilático locais. A administração intravenosa do corante tem sido usado para medir as respostas alérgicas localizadas em modelos animais por quase um século, com publicações que descrevem esta técnica que remonta à década de 1920 ^5. Os coelhos e as cobaias foram os primeiros modelos animais utilizados para testar as reacções de hipersensibilidade imediata, e as respostas foram mais sensíveis geralmente encontrados no ouvido ^5,6. O ensaio foi posteriormente validado para uso em ratos e camundongos ^{7 8.}

Historicamente,uma variedade de métodos experimentais têm sido utilizados, incluindo a injecção de antigénio, antes da injecção do corante, a injecção de corante, antes da injecção de antigénio, e a injecção simultânea de corante e antigénio. Administração intravenosa de corante como um meio para medir as respostas alérgicas é um ensaio versátil, uma vez que pode ser utilizado para medir activa, passiva e inverter reacções passivas ^5,9. Numerosos corantes têm sido utilizados para avaliar as respostas alérgicas, incluindo Trypan Blue, pontamina Céu Azul, Azul de Evans, Geigy Azul 536, e Índia Ink ^5,6,9. Uma solução de 0,5% de azul de Evans é actualmente o corante padrão usado para medir as respostas alérgicas na pele.

A resposta anafilática ao desafio é transitório; intensidade máxima é atingida em 10-15 min de injeção de corante, e nenhuma reação é visível se corante é administrada mais de 30 min após o desafio, independentemente das espécies animais utilizados ^9. Quantificação de extravasamento de corante foi originally obtida pela medição do tamanho da pápula como indicado pelo corante azul ^7-9. Além disso, as contagens de mastócitos desgranulados pode ser quantificado através da excisão de tecido da pele a partir do local da reacção e coloração com azul de toluidina ^7. Desgranulação de mastócitos é muitas vezes usada como um marcador para cutânea, as respostas alérgicas mediadas por IgE, como mastócitos são a população principal de células que expressam o local de alta afinidade de IgE do receptor FceRI. Foram desenvolvidas técnicas de espectrofotometria para medir corante extravasamento para o tecido de anafilaxia cutânea passiva (PCA) no rato e rato ^{10 11} na década de 1990.

O seguinte protocolo de ensaio de anafilaxia local, foi adaptado a partir de Kojima et al. ^1, e utiliza ovalbumina de ovo de galinha (OVA) como antigénio para provocar respostas alérgicas. No entanto, com excepção de OVA antigénios podem ser utilizadas, se desejado. O ensaio, em seguida, utiliza corante azul de Evans para monitorar as mudanças em permeabilit vasculary que ocorrem devido a mastócitos IgE cross-linking e liberação de histamina.

Protocol

1. Sensibilizar Ratos Prepara-se uma solução estoque de OVA por diluição OVA em 1x PBS para uma concentração final de 20 mg / ml. Congelar as alíquotas em criotubos e armazenar a -80 ° C para uso futuro. Trazer uma ou mais alíquotas de 20 mg / ml de caldo de OVA à temperatura ambiente. Dilui-se com OVA em 1x PBS para uma concentração final de 1 mg / ml num tubo de 5 ml de fundo redondo de poliestireno com uma tampa. Vortex para misturar brevemente. Enquanto mantém o tubo de po…

Representative Results

Os animais que tenham sido submetidos a ensaio com êxito terão os olhos ea pele que aparecem em azul. PBS animais sensibilizados não deve reagir a PBS ou desafio com OVA, portanto, ambos os ouvidos deverá permanecer branco (Figura 1A). Em animais sensibilizados com OVA, na orelha recebendo o desafio PBS (esquerda) deve ser completamente branca ou levemente azul de uma maneira localizada no local da injecção. A orelha recebendo o desafio com OVA (direita) deve tornar-se progressivamente mais escura…

Discussion

Inúmeros marcadores de doença alérgica são usados ​​para avaliar a força de respostas alérgicas seguintes desafio alérgeno, incluindo alterações nos níveis de histamina circulante, a produção de citocinas Th2, e recrutamento de células no líquido broncoalveolar no cenário de desafio das vias aéreas. Durante a monitorização de alterações nestes parâmetros é importante para o estudo de reações alérgicas, marcadores biológicos nem sempre têm relação com doença alérgica clínica. O ensaio …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform