Medición anafilaxia local en ratones

Summary

Las respuestas alérgicas, caracterizados por la activación de los mastocitos y basófilos, están impulsados ​​por la reticulación de IgE y liberación de mediadores proinflamatorios. Una evaluación cuantitativa de las respuestas alérgicas se puede lograr mediante el uso de colorante azul de Evans para monitorear los cambios en la permeabilidad vascular después de la provocación con alergeno.

Abstract

Las respuestas alérgicas son el resultado de la activación de los mastocitos y basófilos y la posterior liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios. La exposición a un alérgeno en un individuo sensibilizado puede dar lugar a síntomas clínicos que varían desde leves hasta anafilaxia eritema que amenazan la vida. En el laboratorio, se han desarrollado diversos modelos animales para comprender los mecanismos que impulsan respuestas alérgicas. En este documento, se describe un método detallado para medir los cambios en la permeabilidad vascular para cuantificar las respuestas alérgicas localizadas. El ensayo de la anafilaxia local fue reportado por primera vez en la década de 1920, y ha sido adaptada de la técnica publicada por Kojima et al. en 2007 ^1. En este ensayo, los ratones sensibilizados a OVA son desafiados en el oído izquierdo con vehículo y en la oreja derecha con OVA. Esto es seguido por una inyección intravenosa de colorante azul de Evans. Diez minutos después de la inyección de azul de Evans, el animal es sacrificado y el tinte que se ha extravasado enpara los oídos se extrae durante la noche en formamida. La absorbancia del colorante extraído se cuantificó luego con un espectrofotómetro. Este método da con fiabilidad una manifestación visual y cuantificable de una respuesta alérgica local.

Introduction

Hipersensibilidad de tipo I está mediada por reticulación inducida por el antígeno de la IgE en la superficie de mastocitos y basófilos. Esto da como resultado la desgranulación celular y la liberación de mediadores vasoactivos y proinflamatorios tales como histamina, triptasa, y factor activador de plaquetas ^2. Después de la liberación de mediadores preformados durante la degranulación de los mastocitos sintetizan y liberan prostaglandinas y leucotrienos, que aumentan aún más la permeabilidad vascular ^3. La respuesta clínica inicial se produce rápidamente y se conoce como una "reacción inmediata". En la piel, una respuesta de roncha y eritema es fácilmente visible a pocos minutos de la exposición al antígeno. Dependiendo de la dosis del desafío, es posible observar una "respuesta de fase tardía" unos pocos horas más tarde. Hinchazón de fase tardía se debe a edema localizado y el reclutamiento de leucocitos en los tejidos ^2. La histamina, generalmente considerado como el principal mediador de participar enrespuestas alérgicas inmediatas, actúa sobre los receptores de histamina 1 (HR1) expresó en los buques y los receptores de histamina 2 (HR2) expresado en el músculo liso. El efecto combinado aumenta el flujo sanguíneo y la permeabilidad vascular en el sitio de la inflamación ^4.

Una variedad de modelos animales de la alergia se han desarrollado con el fin de estudiar los mecanismos implicados en la inflamación alérgica, incluyendo modelos de asma alérgica, anafilaxis sistémica y anafilaxia locales. La administración del colorante por vía intravenosa se ​​ha utilizado para medir las respuestas alérgicas localizadas en modelos animales durante casi un siglo, con publicaciones que describe esta técnica que se remonta a la década de 1920 ^5. Los conejos y conejillos de Indias fueron los primeros modelos animales utilizados para probar las reacciones de hipersensibilidad inmediatas, y las respuestas más sensibles se encuentran generalmente en el oído ^5,6. El ensayo fue posteriormente validada para su uso en ratas y ratones ^{7 8.}

Históricamente, losuna variedad de métodos experimentales se han utilizado, incluyendo la inyección del antígeno antes de la inyección de colorante, la inyección de colorante antes de la inyección del antígeno, y la inyección simultánea de tinte y antígeno. La administración del colorante por vía intravenosa como un medio para la medición de las respuestas alérgicas es un ensayo versátil ya que puede ser utilizado para medir activo, pasivo, y revertir reacciones pasivas ^5,9. Numerosos colorantes se han utilizado para evaluar las respuestas alérgicas, incluyendo azul de tripano, pontamina cielo azul, azul de Evans, Geigy Azul 536, y tinta de la India ^5,6,9. Una solución de 0,5% azul de Evans es actualmente el colorante estándar utilizado para medir las respuestas alérgicas en la piel.

La respuesta anafiláctica a desafío es transitoria; intensidad máxima se alcanza de 10 – 15 min de la inyección de colorante, y no hay reacción es visible si tinte se administra más de 30 min después de la exposición, independientemente de las especies animales utilizadas ^9. La cuantificación de la extravasación de colorante era originalLY obtiene midiendo el tamaño de la roncha como se indica por el colorante azul ^7-9. Además, los recuentos de mastocitos desgranulados se pueden cuantificar mediante la escisión de tejido de la piel en el sitio de la reacción y la tinción con azul de toluidina ^7. Degranulación de los mastocitos se utiliza a menudo como un marcador para cutánea, las respuestas alérgicas mediadas por IgE, como mastocitos son la principal población celular local que expresa el receptor de IgE de alta afinidad Fc RI. Se desarrollaron técnicas espectrofotométricas para la medición de la extravasación de colorante en el tejido de la anafilaxia cutánea pasiva (PCA) en la rata y el ratón ^{10 11} en los años 1990.

El siguiente protocolo de ensayo de la anafilaxia local fue adaptado de Kojima et al. ^1, y utiliza la ovoalbúmina de huevo de pollo (OVA) como antígeno para provocar respuestas alérgicas. Sin embargo, los antígenos distintos de OVA se pueden usar si se desea. El ensayo se utiliza colorante azul de Evans para monitorear cambios en permeabilit vasculary que se producen debido a mastocitos IgE entrecruzamiento y la liberación de histamina.

Protocol

1. Ratones Sensibilizar Preparar una solución madre de OVA mediante la dilución de OVA en PBS 1X a una concentración final de 20 mg / ml. Congele por alícuotas en crioviales y almacenar a -80 ° C para su uso futuro. Traiga una o más alícuotas de 20 mg / ml OVA de stock a temperatura ambiente. Diluir OVA en PBS 1X a una concentración final de 1 mg / ml en un tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo con una tapa. Vortex brevemente para mezclar. Mientras sostiene el tubo de polie…

Representative Results

Los animales que han sido sometidos a la prueba con éxito tendrán la piel y los ojos que aparecen de color azul. PBS animales sensibilizados no deben reaccionar a PBS o desafío OVA, por lo tanto ambos oídos deben permanecer blanco (Figura 1A). En los animales sensibilizados OVA, el oído recibir el desafío PBS (izquierda) debe ser completamente blanco o ligeramente azul en forma localizada en el sitio de inyección. El oído recibir el desafío OVA (derecha) debe convertirse en progresivamente más…

Discussion

Numerosos marcadores de la enfermedad alérgica se utilizan para evaluar la solidez de las respuestas alérgicas tras la exposición de alérgenos, incluyendo cambios en los niveles de histamina circulantes, la producción de citocinas Th2, y el reclutamiento de células en el líquido broncoalveolar en el ajuste de la impugnación de las vías respiratorias. Mientras seguimiento de los cambios en estos parámetros es importante para el estudio de las reacciones alérgicas, marcadores biológicos no siempre se correlaci…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31G needle	Terumo	NDC 100861
27G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform