Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.
Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor’s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.
Pattedyrceller linjer kan inddeles i en af tre kategorier baseret på deres vækst karakteristika: celler, der vokser i suspension, celler, der vokser som aggregater, og celler, der vokser forankret til et substrat. Selv om luft-hjulet bioreaktor påvist i denne video er i stand til at vokse alle tre typer af celler, vil denne video demonstrere brugen af bioreaktoren til at vokse forankringsafhængige celler på mikrobærere. Ankerafhængige pattedyrceller kan dyrkes med henblik på fremstilling af flere celler – hvor cellerne selv er produktet. For eksempel er humane knoglemarvsceller afledte mesenkymale stamceller øjeblikket dyrkes med henblik på høst af cellerne og injicere dem i sygt væv. Den pneumatiske bioreaktor demonstreret i denne video har vist sig egnet til fremstilling af sådanne mesenkymale stamceller til denne anvendelse (Serra et al., Personlig kommunikation, 2013).
Anchorage dependent pattedyrceller dyrkes typisk lille målestok i 2D dyrkningsbeholdere såsom cellekultur plader, celledyrkningskolber eller rullekolber, hvor de bekender sig til en specielt behandlet vækst overflade 1. Når der ønskes flere celler, kan de plader eller kolber udvides ved hjælp af mere eller større fartøjer. Dog kan for mere omkostningseffektiv dyrkning af store mængder forankringsafhængige celler, hvilket øger overfladeareal til cellebinding opnås ved anvendelse af små faste perler kaldet mikro-bærere. Afhængigt af redskabernes karakteristika cellen, flere forskellige typer af mikro-bærere er kommercielt tilgængelige, såsom dextran, et peptid eller kollagen coatet. Micro-bærere har et stort overfladeareal volumenforhold giver et større overfladeareal for cellevækst til; og mikro-bærere kan holdes i suspension med omrøring, som tillader, at cellerne dyrkes til høje densiteter i bioreaktor systemer 2. I øjeblikket er de typer af bioreactors hvor adhærente celler dyrket på mikrobærere omfatter spinnerkolber og omrørte tank-systemer, der anvender aksialskovlhjul at opretholde suspensionen af celler belagt mikrobærere.
Adskillige faktorer er vigtige for en vellykket dyrkning af celler, herunder oxygenspænding forskydningsspænding overflade matrix og næringsstoffer og metabolitkoncentrationer. Brugen af bioreaktorer giver mulighed for real-time overvågning af vækstbetingelser og potentiale til betydeligt lavere produktionsomkostninger 1. Der er flere fælles bioreaktor design for dyrkning in vitro-celle, herunder omrørt suspension, roterende væg fartøj, hule fibre, taske bioreaktor på en vippeplatform og systemer med fluidiseret leje 3. Mange af disse systemer præsentere unikke problemer for celledyrkning og skalere -op, såsom høje omkostninger, næringsstof koncentrationsgradienter, hydrodynamiske forskydning, celleaggregering og besvær med prøveudtagning, overvågning og styring af cell opskalering.
Forskellige adhærente cellelinier anvendes i produktionen af virus, enten i produktion af virale vacciner eller til fremstilling af virale vektorer til genterapianvendelser. I denne video, ved hjælp af engangsbrug pneumatisk (luft-hjulet) bioreaktor system, er vi demonstrere dyrkning af humane lungecarcinomceller (A549) celler på mikro-bærere til fremstilling af en onkolytisk adenovirus. Den pneumatiske bioreaktor design bruger et lodret omrøring hjul, der er drevet af opdriften af gas boblet bunden af bioreaktoren. Denne milde omrøring metode begrænser hydrodynamiske forskydningskræfter, men stadig sikrer optimal medium og celle blande 4. I forhold til den omrørte tankreaktor, pneumatiske reaktor har lav væg forskydningsspænding selv med høj lydstyrke Air-Hjul bioreaktor systemer (figur 1). I modsætning til tankomrøring bioreaktorer, er den lodrette pumpehjul engangsbrug reaktor drejes af en strøm af gasbobler indenfartøjet, som giver mulighed for blid og ensartet medium blanding (figur 2).
Denne engangsbrug bioreaktor er relativt enkel at bruge og giver real-time analyser til reaktor overvågning og analyse. Det er yderst velegnet til pattedyr og insekter cellekultur med celletætheder nåede over 30 millioner celler / ml. Udover beskrevne A549-celler i denne rapport 11, har vi dyrket SF-9-insektceller i bioreaktoren samt. Den blide blanding fra den pneumatiske luft hjul reducerer celleskader. Flere trin er kritisk, når oprettelsen af denne reaktor. Først, ordentlig kalibrering af pH og DO sensorer er vigtig for optimal kontrol af kulturen og tilsætning af reagenser til at justere pH eller oxygen i systemet. For det andet skal de reagenser og frø flasker fyldes og de vedhæftede filer luer lavet i et sterilt miljø, såsom et BSC. Når reagensflaskerne bevæges ud af det sterile miljø, skal forbindelserne til bioreaktoren fødeledninger foretages med omhu for at undgå mikrobiel kontaminering.
<pclass = "jove_content"> Selvom denne bioreaktor system fungerer godt for pattedyr og insektcellelinjer det er ikke beregnet til bakteriekulturer. Systemet kan ikke give hurtig blanding og iltning, der er nødvendig for bakterieceller. Bakteriel vækst bedst udføres i en omrørt tank, bioreaktor. I forhold til andre engangsbrug bioreaktorer for pattedyr eller insekt cellekultur, er dette system let at bruge, giver tilstrækkelige data til analyse af kørsler, og har tilsvarende eller bedre cellevækst end den anden engangsbrug system, vi har evalueret.Det engangsbrug pneumatiske bioreaktor system har potentiale til at opfylde mange af forskning og kliniske anvendelser inden for områderne bioterapeutiske, vacciner, stamceller, og personlig medicin 4. Hertil kommer, at fleksibiliteten i dette system giver mulighed for batch, fed-batch, infusion, og transfektion baseret bioreaktor applikationer 5. Endelig engangsbrug bioreaktor systemer har potententielle at opfylde behovene i stor skala industriel produktion og til at overholde retningslinjer og anbefalinger fra nationale og internationale reguleringsorganer 6-10.
The authors have nothing to disclose.
This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
PBS 3 | PBS | n/a | |
Single Use Assembly | PBS | n/a | |
Human Lung Carcinoma Cells (A549) | ATCC | CCL-185 | |
DMEM High Glucose Medium | |||
Fetal Bovine Serum | |||
Trypsin EDTA, 0.25% | |||
Cytodex 1 Microcarriers | GE | 3781 | |
Antifoam C | Sigma | A8011 |