التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي
Summary
توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للتمييز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في العضلية عن طريق تحوير انتقائي مسار WNT، تليها تحليل التدفق الخلوي من علامات مرجعية لتقييم تجانس وهوية السكان.
Abstract
هناك حاجة ملحة لوضع نهج للإصلاح القلب التالفة، واكتشاف العقاقير العلاجية الجديدة التي ليس لها آثار سامة على القلب، وتحسين استراتيجيات لنموذج بدقة أمراض القلب. لا تزال إمكانية استغلال الإنسان الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) التكنولوجيا لتوليد عضلة القلب "في طبق" لهذه التطبيقات لتوليد حماسة عالية. في السنوات الأخيرة، والقدرة على توليد خلايا بكفاءة cardiomyogenic من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) قد تحسنت كثيرا، وتقدم لنا فرصا جديدة لنموذج المراحل المبكرة جدا من التنمية البشرية القلب لا يمكن الوصول إليها على خلاف ذلك. على النقيض من العديد من الطرق السابقة، وصفت بروتوكول التمايز cardiomyocyte هنا لا يتطلب تجميع خلية أو إضافة Activin A أو BMP4 ويولد بقوة الثقافات من الخلايا التي هي ايجابية للغاية لتروبونين القلب الأول وT (TNNI3، TNNT2)، iroquois- بروتين الدرجة homeodomainIRX-4 (IRX4)، ميوسين التنظيمية سلسلة ضوء 2، شكل الإسوي البطين / عضلة القلب (MLC2v) والميوسين التنظيمية سلسلة ضوء 2، شكل الإسوي الأذيني (MLC2a) بعد يوم 10 في جميع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) وخطوط hiPSC اختبار ل التاريخ. خلايا يمكن passaged ويحتفظ به لأكثر من 90 يوما في الثقافة. استراتيجية بسيطة من الناحية الفنية لتنفيذ وفعالة من حيث التكلفة. توصيف العضلية المستمدة من الخلايا المحفزة غالبا ما تتضمن تحليل علامات مرجعية، سواء على مستوى مرنا والبروتين. لتحليل البروتين، والتدفق الخلوي هو أداة تحليلية قوية لتقييم نوعية الخلايا في الثقافة وتحديد الفئات السكانية التجانس. ومع ذلك، والتباين الفني في إعداد العينات يمكن أن تؤثر بشكل كبير نوعية التدفق الخلوي البيانات. وبالتالي، يجب توحيد بروتوكولات تلطيخ تسهيل المقارنات بين استراتيجيات التمايز المختلفة. وفقا لذلك، بروتوكولات تلطيخ الأمثل لتحليل IRX4، MLC2v، MLC2a، TNNI3، وTNNT2 التدفق الخلوي موصوفة.
Introduction
توليد العضلية من hPSCs، بما في ذلك HESC وhiPSC، يمكن أن تعمل لتكون نموذجا في المختبر من العمليات التنموية القلب الإنسان في وقت مبكر جدا، وتوفير نظرة ثاقبة مراحل لا يمكن الوصول إليها إلا للدراسات الميكانيكية. ويوفر هذا النظام نموذجا فرصا فريدة لدراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في التزام النسب القلب ومواصفات مصير الخلية. في السنوات الأخيرة، والقدرة على توليد خلايا cardiomyogenic بكفاءة من hPSCs قد تحسنت كثيرا 1-15. ومع ذلك، من بين البروتوكولات هناك خط الخلية الاختلاف فيما يتعلق الكفاءة في توليد خلايا cardiomyogenic والتوقيت في الخلايا التي تبدي علامات غرفة محددة (على سبيل المثال، البطين والأذين). من الناحية المثالية، للتطبيقات المستقبلية لهذا النظام النموذجي، والمطلوب السكان أكثر تجانسا من خلايا محددة وظيفيا. على النقيض من الطرق السابقة، وصفت بروتوكول التمايز cardiomyocyte هنا لا يتطلب متجميع ليرة لبنانية أو إضافة Activin A أو العظام تخلقية بروتين 4 (BMP4) وبقوة يولد الثقافات إيجابية للغاية لTNNI3، TNNT2، IRX4، MLC2v، وMLC2a بعد يوم 10 خلايا في جميع HESC وhiPSC خطوط اختبار حتى الآن. استراتيجية بسيطة من الناحية الفنية لتنفيذ، لا سيما بالمقارنة مع الثقافات ثلاثية الأبعاد، الثقافة الجماهيرية، أو استراتيجيات الجسم مضغي الشكل مقرها 4-9، وحددت مؤخرا في الدراسة أن يصف جزيء صغير مع سمية انتقائية لhPSCs (Boheler وآخرون. ) 65. ميزات هذا البروتوكول تشمل تمايز hPSCs في الثقافة أحادي الطبقة باستخدام طبقة واحدة من HESC مصفوفة المؤهلة (Matrigel)، ووسائل الإعلام تعرف تماما باستخدام جزيئات صغيرة لتعدل إشارات WNT (مماثلة، متميزة بعد من 1،2،7،13)، و التدفق الأمثل الخلوي أساليب تلطيخ لتقييم كفاءة التمايز والهوية الخلية. باختصار، مزايا هذا البروتوكول مقارنة تتضمن التقارير السابقة، فعاليه التكاليفeness، استنساخ، والكفاءة العالية لتوليد العضلية بين خطوط hPSC متعددة، بما في ذلك HESC وhiPSC خطوط.
التدفق الخلوي هو أداة تحليلية قوية لتقييم نوعية الخلايا في الثقافة وتحديد الفئات السكانية التجانس، ومع التصميم التجريبي المناسب، ويمكن أن توفر القياسات الكمية. كما هو الحال مع جميع الاستراتيجيات المعتمدة على الأجسام المضادة، وتفسير دقيق للنتائج التجريبية يتطلب أن عناصر التصميم بما في ذلك فحص تركيز الأجسام المضادة وتثبيت والظروف permeabilization (عند استهداف مستضدات الخلايا) يتم اختبارها بعناية لكل الأجسام المضادة كشروط دون المستوى الأمثل تؤثر تأثيرا كبيرا على فعالية الأجسام المضادة ملزمة، وبالتالي، وتفسير النتائج. الأهم من ذلك، إذا كان مطلوبا الكميات، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضرورية، كما يمكن التعرف على الأجسام المضادة الحواتم متعددة وعرضة لاختلاف دفعة إلى دفعة. حاليا، ومجموعة متنوعة من الأجسام المضادة (أ ف بوقد وصفت lyclonal وحيدة النسيلة) وتلطيخ بروتوكولات لتقييم التمايز في المختبر، مما يجعل من الصعب مقارنة كفاءة cardiomyogenesis بين بروتوكولات 1،2،9،11. لهذا السبب، وتستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عندما تكون متاحة لجميع يحلل تدفق الخلوي. للمضي قدما، فمن المتوقع أن توحيد هذه البروتوكولات تلطيخ، وخاصة فيما يتعلق الكميات، يجب أن تسمح أفضل مقارنة بين استراتيجيات التمايز.
اختيار علامات، والأجسام المضادة يناظرها، وتستخدم لتقييم نقاء في المختبر cardiomyogenesis يختلف بين التقارير. وقد اعتبر TNNT2 مؤشرا على خلايا ملتزمة مصير cardiomyogenic ويستخدم بشكل روتيني لتقييم كفاءة بروتوكولات التمايز القلب. ومع ذلك، أعرب TNNT2 أيضا في العضلات والهيكل العظمي خلال فرخ الجرذ والتنمية في وقت مبكر 16،17 وكان موجودا في العضلات الملساء الإنسان 18 </sup>. وبالتالي، TNNT2 ليس بالضرورة علامة محددة من cardiomyogenesis البشرية في المختبر. تستخدم MLC2v وMLC2a بشكل روتيني كعلامات بديلة البطيني والأذيني فرعية، على التوالي. ومع ذلك، مع الاعتماد على التحديات MLC2v وMLC2a لتحديد النوع الفرعي cardiomyocyte في سياق التمايز في المختبر تنشأ من حقيقة أن هذه المنتجات الجين قد لا يقتصر على غرفة محددة في جميع أنحاء التطوير القلب، من القلب عن طريق أنبوب الكبار. في القوارض يحلق القلب، MLC2a مرنا هو السائد في الأذيني / تدفق منطقة القناة وMLC2v مرنا غير السائد في المناطق المسالك البطين / تدفق. في قلب يحلق، ويلاحظ وشارك في التعبير عن MLC2a وMLC2v من mRNAs في الجهاز تدفق، القناة الأذينية البطينية، والمسالك تدفق 19،20. قبل 3 أيام بعد الولادة، ويقتصر MLC2v مرنا إلى البطين و10 يوما بعد الولادة، ويقتصر MLC2a إلى الأذينين في القلب الفئران حديثي الولادة 19. وبالتالي، تفسيرالبيانات المتعلقة الكفاءة cardiomyogenesis وهوية النوع الفرعي يجب أن لا تنظر فقط وجود وكمية من مستويات علامة مرجعية، ولكن يجب النظر في مرحلة التطوير (ق) التي تكون timepoints التمايز التي تتوافق تحليلها. هذا مهم خصوصا أن مرحلة نضوج خلايا cardiomyogenic التي تولدها في المختبر تمايز hPSCs الأكثر شبها تلك الجنينية الإنمائي / الجنين 21-25. وهكذا، والاعتماد على التعبير علامة في المكاني في قلب ما بعد الولادة قد لا يكون مناسبا لتقييم hPSC الخلايا المشتقة، على الأقل في بعض الحالات.
في محاولة لتسهيل وضع معايير أكثر تحديدا لتحديد هوية cardiomyocyte في المختبر، ويعتبر TNNI3 أن تكون علامة قيمة لتقييم cardiomyogenesis في المختبر كما هو يقتصر على عضلة القلب طوال مرحلة التطور الجنيني في الفرخ والزرد 15،20وتغيب في الإنسان العضلات الهيكلية الجنين 26. بينما TNNI1 موجود في قلب الجنين البشري، TNNI3 هو الوحيد الحاضر في شكل الإسوي TNNI الكبار العادي القلب 27،28. وفيما يتعلق cardiomyocyte هوية النوع الفرعي، IRX4 29-31 هو علامة بالمعلومات الخلايا مع مصير البطين. على مستوى البروتين، تم مؤخرا أظهرت IRX4 أن يقتصر على البطين من أنبوب القلب الخطي من خلال مراحل الولدان في الماوس 32. وفقا لذلك، يتم وصف البروتوكولات تلطيخ الأمثل لتحليل TNNI3 وIRX4 بواسطة التدفق الخلوي. على حد علمنا، هذا هو الوصف الأول من طريقة لكفاءة تلطيخ القائم على الأجسام المضادة وتحليل مستويات IRX4 العضلية في الإنسان من خلال التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاسمة لنجاح بروتوكول التمايز هو استخدام نوعية عالية من الثقافات hPSCs التي تم passaged على مستوى خلية واحدة على الأقل لمدة خمس فقرات قبل بداية التمايز. ويلاحظ كفاءات مماثلة التمايز بشكل روتيني بين مختلف خطوط hPSC إذا كانت 100٪ متكدسة في بداية التمايز ومستقلة من خط الخلية. ويلا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة 4R00HL094708-03، لجنة جائزة كلية جديد MCW شؤون البحث العلمي، ومؤسسة كيرن (أموال بدء التشغيل) في كلية الطب في ويسكونسن (RLG). مجلس المنح البحثية لذو فكرة هونغ كونغ خطة البحوث T13-706 / 11 (KRB). U01 HL099776، CIRM TR3-05556، CIRM DR2A-05394، وAHA تأسست جائزة الباحث (JCW). AHA زمالة ما بعد الدكتوراه 12POST12050254 (برنامج العمل والميزانية). نشكر الأمل كامبل في التدفق الخلوي الأساسية من معهد أبحاث الدم ويسكونسن للمساعدة في جمع البيانات ومراجعة متأنية للمخطوطة.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
Riferimenti
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
- Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
- Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
- Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
- Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
- Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
- Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
- Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
- Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
- Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
- Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
- Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
- Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
- Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
- Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
- Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
- Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
- Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
- Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
- Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
- Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
- Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk–sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
- Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
- Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
- Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1. HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
- Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
- Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
- Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
- Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
- Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
- Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
- Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
- Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
- Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
- Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
- Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
- Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
- Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
- Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
- Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
- Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
- Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
- Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
- Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
- Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
- Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao, ., Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).
