High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie
Summary
Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.
Abstract
Er is een dringende noodzaak om de aanpak voor het repareren van het beschadigde hart, het ontdekken van nieuwe therapeutische geneesmiddelen die geen toxische effecten op het hart hebben, en het verbeteren van de strategieën om nauwkeurig te modelleren hart-en vaatziekten te ontwikkelen. Het potentieel van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) technologie benutten om de hartspier te genereren "in een schotel" voor deze toepassingen blijft hoog enthousiasme te genereren. De laatste jaren heeft de mogelijkheid om efficiënt genereren cardiomyogene cellen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) sterk verbeterd, biedt ons nieuwe mogelijkheden model zeer vroege stadia van menselijke hartontwikkeling zonder dergelijke. In tegenstelling tot vele eerdere werkwijzen hartspierdifferentiatie protocol beschreven here ofwel geen celaggregatie of toevoeging van activine A of BMP4 vereisen en robuust genereert celkweken die sterk positief zijn voor cardiaal troponine I en T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klasse homeodomein eiwitIRX-4 (IRX4), myosine regulerende lichte keten 2, ventriculaire / hartspier isovorm (MLC2v) en myosine regulerende lichte keten 2, atriale isovorm (MLC2a) op dag 10 in alle menselijke embryonale stamcellen (hESC) en hiPSC lijnen getest datum. Cellen kunnen worden gepasseerd en onderhouden voor meer dan 90 dagen in de cultuur. De strategie is technisch eenvoudig te implementeren en kosteneffectief. Karakterisering van cardiomyocyten afgeleid van pluripotente cellen omvat vaak de analyse van referentiemarkeringen, zowel op mRNA en eiwitniveau. Voor eiwitanalyse flowcytometrie een krachtig analytisch hulpmiddel voor de beoordeling van cellen in kweek en het bepalen subpopulatie homogeniteit. Echter, technische variatie in monstervoorbereiding significante invloed kwaliteit van flowcytometrie data. Daarom moet standaardisatie van kleuringsprotocollen vergelijkingen tussen verschillende differentiatie strategieën vergemakkelijken. Bijgevolg geoptimaliseerd kleuringsprotocollen voor de analyse van IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 en TNNT2 door flowcytometrie beschreven.
Introduction
De generatie van hartspiercellen uit hPSCs, inclusief hESC en hiPSC, kan functioneren als een in vitro model van de zeer vroege menselijke cardiale ontwikkelingsprocessen, die inzicht geven in etappes anders niet toegankelijk zijn voor mechanistische studies. Dit model biedt unieke mogelijkheden om de moleculaire pathways die cardiale lineage inzet en lot van de cel specificatie controle te bestuderen. De laatste jaren heeft de mogelijkheid om efficiënt genereren cardiomyogene cellen van hPSCs sterk verbeterd 1-15. Echter, onder protocollen er cellijn variatie met betrekking tot de efficiëntie van het genereren cardiomyogene cellen en timing waarmee de cellen tot expressie kamer merkers (bijvoorbeeld ventrikel en atria). Idealiter voor toekomstige toepassingen van dit modelsysteem homogenere populatie van functioneel gedefinieerde cellen gewenst. In tegenstelling tot eerdere methoden hartspierdifferentiatie protocol beschreven here ofwel ce vereisenll aggregatie of de toevoeging van Activin A of Bone morfogenetische eiwit 4 (BMP4) en robuust genereert culturen zeer positief voor TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v en MLC2a bij dag 10 cellen in alle hESC en hiPSC lijnen getest tot nu toe. De strategie is technisch eenvoudig te implementeren, vooral in vergelijking met driedimensionale kweken, massacultuur of embryoid body strategieën 4-9, en is recentelijk gedefinieerd in een studie die een klein molecuul met selectieve toxiciteit voor hPSCs beschreven (Boheler et al. ) 65. Kenmerken van dit protocol zijn onder andere differentiatie van hPSCs in monolaagkweek behulp van een enkele laag van een hESC gekwalificeerde matrix (Matrigel), volledig gedefinieerde media met behulp van kleine moleculen aan Wnt-signalering (vergelijkbaar, maar toch onderscheiden van 1,2,7,13) moduleren, en geoptimaliseerde flowcytometrie kleuring methoden voor het evalueren van differentiatie efficiency en celidentiteit. Kortom, de voordelen van dit protocol vergeleken met de vorige verslagen zijn onder meer de kosten-effectiveness, reproduceerbaarheid, en zijn hoge efficiency voor het genereren van hartspiercellen tussen meerdere HPSC lijnen, met inbegrip van hESC en hiPSC lijnen.
Flow cytometrie is een krachtige analytische tool voor het beoordelen van de kwaliteit van de cellen in de cultuur en het bepalen subpopulatie homogeniteit, en met de juiste experimentele opzet, kan kwantitatieve metingen geven. Zoals met alle antilichamen gebaseerde strategieën, nauwkeurige interpretatie van experimentele resultaten vereist dat elementen van de test ontwerp met inbegrip van de concentratie en fixatie antilichaam en permeabilisatie voorwaarden (wanneer de doelgroep intracellulaire antigenen) worden zorgvuldig getest voor elk antilichaam als sub-optimale omstandigheden aanzienlijk efficiëntie van antilichaam invloed bindend, en dus, de interpretatie van de resultaten. Belangrijk, indien kwantificatie nodig, monoklonale antilichamen zijn essentieel als polyklonale antilichamen meerdere epitopen herkennen en zijn gevoelig voor batch-to-batch variatie. Momenteel, verschillende antilichamen (polyclonal en monoklonaal) en kleuring protocollen zijn beschreven voor de beoordeling van de in vitro differentiatie, waardoor het moeilijk is om de efficiëntie van cardiomyogenesis onder protocollen 1,2,9,11 vergelijken. Daarom zijn monoklonale antilichamen die beschikbaarheid voor flowcytometrie geanalyseerd. In de toekomst wordt verwacht dat normalisatie van deze kleuringsprotocollen, vooral met betrekking tot kwantificatie, moet vergelijking tussen differentiatiestrategieën beter mogelijk.
De keuze van merkers, en hun overeenkomstige antilichamen worden gebruikt om de zuiverheid van in vitro cardiomyogenesis beoordelen varieert tussen rapporten. TNNT2 is beschouwd als een indicator van de cellen zich in voor de cardiomyogene lot en wordt routinematig gebruikt om de efficiëntie van de cardiale differentiatie protocollen te beoordelen. Echter, wordt TNNT2 ook tot uitdrukking in de skeletspier tijdens de vroege chick en rat ontwikkeling 16,17 en het aanwezig is in de menselijke gladde spier 18 is </sup>. Aldus TNNT2 niet noodzakelijk een specifieke marker van humane cardiomyogenesis in vitro. MLC2v en MLC2a worden routinematig gebruikt als surrogaat markers van ventriculaire en atriale subtypes, respectievelijk. Echter, de uitdagingen met vertrouwen op MLC2v en MLC2a om cardiomyocyte subtype te bepalen in het kader van de in vitro differentiatie voort uit het feit dat deze genproducten niet kan worden beperkt tot een specifieke kamer hele ontwikkeling van het hart, van het hart buis door volwassenen. In een lus het knaagdier hart, MLC2a mRNA is overheersend in het atrium / instroom darmkanaal gebied en MLC2v mRNA is overheersend in de ventriculaire / uitstroombaan regio. In de lus hart, co-expressie van MLC2a en MLC2v mRNA waargenomen in de instroom darmkanaal, atrioventriculaire kanaal, en de uitstroom 19,20. Bij 3 dagen na de geboorte, is MLC2v mRNA beperkt tot de ventrikel en 10 dagen na de geboorte, is MLC2a beperkt tot de atria in de neonatale rat hart 19. Daarom interpretatievan gegevens betreffende cardiomyogenesis efficiency en subtype identiteit niet alleen naar de aanwezige hoeveelheid referentiemarkering niveaus, maar moet overwegen het ontwikkelingsstadium (s) waarop de tijdstippen van differentiatie die geanalyseerd overeenkomen. Dit is bijzonder belangrijk aangezien de rijpingsfase van cardiomyogene cellen gegenereerd door in vitro differentiatie van hPSCs lijkt meest die van embryonale / foetale ontwikkeling 21-25. Dus, met een beroep op een marker ruimtelijke expressie in de postnatale hart misschien niet geschikt voor de beoordeling van HPSC-afgeleide cellen, althans in sommige gevallen.
In een poging om de ontwikkeling van meer specifieke criteria voor het bepalen van identiteit cardiomyocyten in vitro te vergemakkelijken, wordt TNNI3 beschouwd als een waardevolle marker voor het evalueren cardiomyogenesis in vitro kunnen alleen de hartspier gedurende embryogenese in kuiken en zebravis 15,20 zijnen afwezig is in menselijke foetale skeletspier 26. Terwijl TNNI1 aanwezig in humane foetale hart is, TNNI3 is de enige TNNI isovorm aanwezig is in de normale volwassen hart 27,28. Wat betreft cardiomyocyte subtype identiteit, IRX4 29-31 is een informatieve marker van cellen met een ventriculaire lot. Op het eiwitniveau, is IRX4 onlangs aangetoond worden beperkt tot de ventrikel van lineaire hartbuis door neonatale stadia van de muis 32. Bijgevolg geoptimaliseerd kleuringsprotocollen voor de analyse van TNNI3 en IRX4 door flowcytometrie beschreven. Bij ons weten is dit de eerste beschrijving van een werkwijze voor efficiënte antilichamen gebaseerde kleuring en analyse van IRX4 niveaus in cardiomyocyten door flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cruciaal voor het succes van de differentiatie protocol is het gebruik van hoge kwaliteit culturen van hPSCs die zijn gepasseerd op enkele cel niveau minstens vijf passages voor het begin van differentiatie. Soortgelijke differentiatie efficiënties routinematig waargenomen bij verschillende HPSC lijnen als ze 100% confluent bij aanvang van differentiatie, onafhankelijk van cellijn. Suboptimale efficiëntie wordt waargenomen wanneer de cellen samenvloeiing van begin differentiatie ≤95% of> 100%. Daarom moet zaaidic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door NIH 4R00HL094708-03, MCW Onderzoek Zaken Comite Nieuwe Faculty Award, en de Kern foundation (startup fondsen) aan het Medical College of Wisconsin (RLG); Research Grants Council van Hong Kong Thema-based Research Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2a-05394, en AHA Established Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoraal Fellowship 12POST12050254 (PWB). Wij danken Hope Campbell bij de flowcytometrie Kern van het Bloed Instituut van Wisconsin voor hulp bij het verzamelen van gegevens en een zorgvuldige beoordeling van het manuscript.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
Riferimenti
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
- Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
- Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
- Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
- Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
- Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
- Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
- Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
- Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
- Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
- Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
- Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
- Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
- Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
- Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
- Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
- Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
- Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
- Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
- Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
- Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
- Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk–sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
- Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
- Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
- Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1. HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
- Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
- Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
- Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
- Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
- Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
- Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
- Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
- Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
- Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
- Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
- Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
- Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
- Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
- Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
- Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
- Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
- Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
- Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
- Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
- Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
- Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao, ., Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).
