Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso
Summary
L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.
Abstract
Vi è un urgente bisogno di sviluppare approcci per riparare il cuore danneggiato, la scoperta di nuovi farmaci terapeutici che non hanno effetti tossici sul cuore, e migliorare le strategie per modellare con precisione la malattia di cuore. Il potenziale di sfruttare la tecnologia umana indotto cellule staminali pluripotenti (hiPSC) per generare il muscolo cardiaco "in un piatto" per queste applicazioni continua a generare entusiasmo alto. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) è notevolmente migliorata, offrendoci nuove opportunità di modellare primissime fasi dello sviluppo cardiaco umano non altrimenti accessibili. A differenza di molti metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede l'aggregazione delle cellule o l'aggiunta di Activin A o BMP4 e genera robusta colture di cellule che sono altamente positivo per la troponina cardiaca I e T (TNNI3, TNNT2), Iroquois proteine classe homeodomainIRX-4 (IRX4), miosina catena leggera normativo 2, isoforma ventricolare / muscolo cardiaco (MLC2v) e miosina catena leggera normativo 2, isoforma atriale (MLC2a) dal giorno 10 in tutti cellule staminali embrionali umane (hESC) e le linee hiPSC testato per data. Le celle possono essere diversi passaggi e mantenuti per più di 90 giorni di coltura. La strategia è tecnicamente semplice da implementare e conveniente. Caratterizzazione dei cardiomiociti derivati da cellule pluripotenti spesso include l'analisi dei marcatori di riferimento, sia a livello di mRNA e proteine. Per l'analisi delle proteine, citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità. Tuttavia, la variazione tecnica in preparazione del campione può influenzare significativamente la qualità della citometria a flusso di dati. Così, la standardizzazione dei protocolli di colorazione dovrebbe facilitare il confronto tra le varie strategie di differenziazione. Di conseguenza, ottimizzati protocolli di colorazione per l'analisi di IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 mediante citometria di flusso sono descritti.
Introduction
La generazione di cardiomiociti da hPSCs, tra cui hESC e hiPSC, può funzionare come un modello in vitro di molto precoci processi di sviluppo cardiache umane, permettono di approfondire le fasi non altrimenti accessibili per gli studi meccanicistici. Questo modello di sistema fornisce opportunità uniche per studiare i meccanismi molecolari che controllano l'impegno lignaggio cardiaco e le specifiche destino cellulare. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da hPSCs è notevolmente migliorata 1-15. Tuttavia, tra protocolli c'è variazione linea cellulare rispetto alla efficienza nella generazione di cellule cardiomyogenic ei tempi in cui le cellule esprimono marcatori specifici a camera (per esempio, ventricolo e atri). Idealmente, per le future applicazioni di questo sistema modello, le popolazioni più omogenee di cellule funzionalmente definiti sono desiderati. In contrasto con i metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede cell aggregazione o l'aggiunta di Activin A o proteina morfogenetica dell'osso 4 (BMP4) e robusta genera culture molto positivo per TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, e MLC2a di giorno 10 celle in tutte le linee di hESC e hiPSC testati fino ad oggi. La strategia è tecnicamente semplice da realizzare, soprattutto rispetto a culture tridimensionali, cultura di massa, o strategie corpo embrioide basate 4-9, ed è stato recentemente definito in uno studio che descrive una piccola molecola con tossicità selettiva per hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caratteristiche di questo protocollo sono la differenziazione delle hPSCs in coltura monostrato utilizzando un singolo strato di una matrice qualificato hESC (Matrigel), mezzi di questo tipo utilizzando piccole molecole di modulare la segnalazione Wnt (simile, ma distinto da 1,2,7,13), e citometria a flusso ottimizzato metodi di colorazione per la valutazione dell'efficienza differenziazione e l'identità delle cellule. In sintesi, i vantaggi di questo protocollo rispetto alle relazioni precedenti comprendono il suo costo-effectiveness, riproducibilità, e la sua elevata efficienza per la generazione di cardiomiociti tra più linee HPSC, comprese le linee di hESC e hiPSC.
La citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità, e con una corretta progettazione sperimentale, in grado di fornire misurazioni quantitative. Come per tutte le strategie a base di anticorpi, accurata interpretazione dei risultati sperimentali richiede che gli elementi del disegno dosaggio compreso concentrazione di anticorpi e di fissazione e permeabilizzazione (quando le condizioni di targeting antigeni intracellulari) sono accuratamente testati per ogni anticorpo in condizioni sub-ottimali influenzano in modo significativo l'efficienza di anticorpi vincolante, e quindi, l'interpretazione dei risultati. È importante sottolineare che, se è richiesta la quantificazione, gli anticorpi monoclonali sono essenziali, come gli anticorpi policlonali possono riconoscere più epitopi e sono soggetti a variazioni da lotto a lotto. Attualmente, una varietà di anticorpi (posono stati descritti i protocolli lyclonal e monoclonali) e colorazione per la valutazione di differenziazione in vitro, il che rende difficile confrontare l'efficienza di cardiomiogenesi tra protocolli 1,2,9,11. Per questo motivo, gli anticorpi monoclonali vengono utilizzati quando disponibili per tutte le analisi di citometria a flusso. Andando avanti, si prevede che la standardizzazione di questi protocolli di colorazione, soprattutto per quanto riguarda la quantificazione, dovrebbe consentire una migliore comparazione tra le strategie di differenziazione.
La scelta di marcatori, e le loro corrispondenti anticorpi, utilizzato per valutare la purezza di in vitro cardiomiogenesi varia tra i rapporti. TNNT2 è stato considerato un indicatore di cellule impegnate nel destino cardiomyogenic ed è solitamente usata per valutare l'efficienza dei protocolli di differenziamento cardiaci. Tuttavia, TNNT2 si esprime anche nel muscolo scheletrico durante l'inizio pulcino e ratto sviluppo 16,17 ed è presente nel muscolo liscio umano 18 </sup>. Così, TNNT2 non è necessariamente un marcatore specifico della cardiomiogenesi umana in vitro. MLC2v e MLC2a sono abitualmente utilizzati come marcatori surrogati di ventricolari ed atriali sottotipi, rispettivamente. Tuttavia, le sfide con basandosi su MLC2v e MLC2a per determinare cardiomiociti sottotipo nel contesto di differenziazione in vitro derivano dal fatto che questi prodotti genici non possono essere limitati a una specifica camera durante lo sviluppo cardiaco, dal tubo cuore attraverso adulto. Nel roditore loop cuore, MLC2a mRNA è predominante nella atriale / zona del tratto di afflusso e MLC2v mRNA è predominante nelle regioni del tratto ventricolare / deflusso. Nel cuore loop, co-espressione di MLC2a e MLC2v mRNA si osservano nel tratto di afflusso, canale atrioventricolare, e il tratto di efflusso 19,20. Entro 3 giorni dopo la nascita, MLC2v mRNA è limitato al ventricolo e di 10 giorni dopo la nascita, MLC2a è limitata alla atri neonatale nel ratto cuore 19. Pertanto, l'interpretazionedei dati riguardanti l'efficienza cardiomiogenesi e identità sottotipo deve non solo considerare la presenza e la quantità di livelli di marcatori di riferimento, ma deve prendere in considerazione lo stadio di sviluppo (s) a cui i punti temporali di differenziazione che vengono analizzati corrispondono. Ciò è particolarmente importante se si considera che la fase di maturazione delle cellule cardiomyogenic generate dalla differenziazione in vitro di hPSCs assomiglia più da vicino quelle di sviluppo embrionale / fetale 21-25. Così, basandosi su espressione spaziale di un marcatore nel cuore postnatale potrebbe non essere adatto per la valutazione delle cellule HPSC-derivate, almeno in alcuni casi.
Nel tentativo di agevolare lo sviluppo di criteri più specifici per definire l'identità dei cardiomiociti in vitro, TNNI3 è considerato un indicatore importante per valutare cardiomiogenesi in vitro in quanto è limitato al muscolo cardiaco durante l'embriogenesi in pulcino e zebrafish 15,20ed è assente nel feto umano muscolo scheletrico 26. Mentre TNNI1 è presente nel cuore fetale umano, TNNI3 è la sola isoforma TNNI presente nel cuore adulto normale 27,28. Per quanto riguarda cardiomiociti sottotipo identità, IRX4 29-31 è un marcatore informativa di cellule con un destino ventricolare. A livello di proteine, IRX4 è stato recentemente dimostrato di essere limitato al ventricolo dal tubo lineari cuore attraverso le fasi neonatali nel topo 32. Di conseguenza, sono descritti protocolli di colorazione ottimizzati per l'analisi di TNNI3 e IRX4 mediante citometria a flusso. A nostra conoscenza, questa è la prima descrizione di un metodo efficace per la colorazione a base di anticorpi e l'analisi dei livelli di IRX4 in cardiomiociti umani mediante citometria a flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fondamentale per il successo del protocollo di differenziazione è l'uso di colture di alta qualità hPSCs che sono state fatte passare a livello di singola cellula per almeno cinque passaggi prima dell'inizio della differenziazione. Efficienze di differenziazione simili sono regolarmente osservate tra varie linee HPSC se sono 100% confluenti all'inizio di differenziazione, indipendentemente linea cellulare. Efficienza non ottimale si osserva se la confluenza delle cellule all'inizio della differenziazio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal NIH 4R00HL094708-03, MCW affari di ricerca Comitato New Faculty Award, e la fondazione Kern (fondi di avvio) presso il Medical College of Wisconsin (RLG); Research Grants Consiglio tematico Hong Kong Scheme ricerca T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, e AHA Fondata Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Ringraziamo Speranza Campbell al Citometria a flusso Nucleo del Sangue Research Institute of Wisconsin per l'assistenza con la raccolta dei dati e un'attenta revisione del manoscritto.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
Riferimenti
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