Method Article

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

DOI:

10.3791/52010

⸱

September 23rd, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

In This Article

Summary

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L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Abstract

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Vi è un urgente bisogno di sviluppare approcci per riparare il cuore danneggiato, la scoperta di nuovi farmaci terapeutici che non hanno effetti tossici sul cuore, e migliorare le strategie per modellare con precisione la malattia di cuore. Il potenziale di sfruttare la tecnologia umana indotto cellule staminali pluripotenti (hiPSC) per generare il muscolo cardiaco "in un piatto" per queste applicazioni continua a generare entusiasmo alto. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) è notevolmente migliorata, offrendoci nuove opportunità di modellare primissime fasi dello sviluppo cardiaco umano non altrimenti accessibili. A differenza di molti metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede l'aggregazione delle cellule o l'aggiunta di Activin A o BMP4 e genera robusta colture di cellule che sono altamente positivo per la troponina cardiaca I e T (TNNI3, TNNT2), Iroquois proteine ​​classe homeodomainIRX-4 (IRX4), miosina catena leggera normativo 2, isoforma ventricolare / muscolo cardiaco (MLC2v) e miosina catena leggera normativo 2, isoforma atriale (MLC2a) dal giorno 10 in tutti cellule staminali embrionali umane (hESC) e le linee hiPSC testato per data. Le celle possono essere diversi passaggi e mantenuti per più di 90 giorni di coltura. La strategia è tecnicamente semplice da implementare e conveniente. Caratterizzazione dei cardiomiociti derivati ​​da cellule pluripotenti spesso include l'analisi dei marcatori di riferimento, sia a livello di mRNA e proteine. Per l'analisi delle proteine, citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità. Tuttavia, la variazione tecnica in preparazione del campione può influenzare significativamente la qualità della citometria a flusso di dati. Così, la standardizzazione dei protocolli di colorazione dovrebbe facilitare il confronto tra le varie strategie di differenziazione. Di conseguenza, ottimizzati protocolli di colorazione per l'analisi di IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 mediante citometria di flusso sono descritti.

Introduction

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La generazione di cardiomiociti da hPSCs, tra cui hESC e hiPSC, può funzionare come un modello in vitro di molto precoci processi di sviluppo cardiache umane, permettono di approfondire le fasi non altrimenti accessibili per gli studi meccanicistici. Questo modello di sistema fornisce opportunità uniche per studiare i meccanismi molecolari che controllano l'impegno lignaggio cardiaco e le specifiche destino cellulare. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da hPSCs è notevolmente migliorata 1-15. Tuttavia, tra protocolli c'è variazione linea cellulare rispetto alla efficienza nella generazio....

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Protocol

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1 Soluzione e preparazione media

  1. hESC Matrix qualificato Rivestimento Stock Solution
    1. Lentamente scongelare hESC matrice qualificato (5 ml) su ghiaccio a 4 ° C durante la notte. Distribuire aliquote in provette da microcentrifuga pre-refrigerati, 1,5 ml sterile e conservare a -20 ° C immediatamente.
      NOTA: Il volume della parte aliquota prelevata variano in base alla partita e varia tipicamente 270-350 ml. Produttore fornisce dettagli riguardanti il ​​volume di aliquota necessaria per ottenere una concentrazione 1x sulla diluizione in 25 ml come descritto al punto 2.1.
  2. HPSC media Immagini Solutions
    1. Utilizzare acqu....

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Results

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Il giorno 0, le cellule sono al 100% confluenti con morfologia compatta e detriti cellulari minima. Nei giorni 1-2, è comune osservare significativo morte cellulare (40-50%), ma le cellule attaccate manterrà morfologia compatta (Figura 1A). Durante questo periodo, i media è arancione e torbido. Rosa supporto indica morte cellulare eccessiva, e in questo caso, confermare con trypan blu e interrompere se la morte cellulare supera il 70%. Le cellule si riprenderà nei giorni 3-4 e la densità aumenteranno. D.......

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Discussion

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Fondamentale per il successo del protocollo di differenziazione è l'uso di colture di alta qualità hPSCs che sono state fatte passare a livello di singola cellula per almeno cinque passaggi prima dell'inizio della differenziazione. Efficienze di differenziazione simili sono regolarmente osservate tra varie linee HPSC se sono 100% confluenti all'inizio di differenziazione, indipendentemente linea cellulare. Efficienza non ottimale si osserva se la confluenza delle cellule all'inizio della differenziazione.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questa ricerca è stata sostenuta dal NIH 4R00HL094708-03, MCW affari di ricerca Comitato New Faculty Award, e la fondazione Kern (fondi di avvio) presso il Medical College of Wisconsin (RLG); Research Grants Consiglio tematico Hong Kong Scheme ricerca T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, e AHA Fondata Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Ringraziamo Speranza Campbell al Citometria a flusso Nucleo del Sangue Research Institute of Wisconsin per l'assistenza con la raccolta dei dati e un'attenta revisione del manoscritto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
BD Matrigel, matrice qualificata hESCBD Biosciences354277
distacco di cellule accutasiStem Cell Technologies7920
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), senza calcio, senza magnesioLife Technologies14190-136
Dimetilsolfossido (DMSO, Hybri-Max, filtrato sterile)Sigma AldrichD2650
Bicarbonato di sodioSigma Aldrich53817
Acido citricoSigma AldrichC2404-100G
Y-27632 dicloridrato inibitore selettivo p160ROCK R& D Systems1254
Acido L-ascorbico-2-fosfato sale di sesquimagnesio idratoSigma AldrichA8960-5G
Selenito di sodioSigma AldrichS5261-10G
Transferrina (Optiferrin - ndash; Definito, senza animali, ricombinante umano)Invitria777TRF029
Fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2)R& D Systems4144-TC-01M
Fattore di crescita trasformante beta 1 (TGFβ 1)Peprotech100-21
DMEM/F12 con L-Glutammina e 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
InsulinaSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640 con L-GlutamminaLife Technologies11875-093
Integratore B-27 Minus InsulinLife TechnologiesA1895601
Integratore B-27 (con insulina)Life Technologies17504-044
Siero fetale bovinoLife Technologies10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca2+ e Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Phosflow perm buffer IIIBD Biosciences558050
16% ParaformaldeideThermo Scientific28906
MetanoloSigma Aldrich179957-4L
AcetoneMallenckrodt Chemicals 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Siero di capraLife Technologies16210-064
Soluzione di blu di tripano, 0,4%Life Technologies15250-061
Materials
5 ml Tubo in polistirene a fondo tondo (senza tappo)Corning352008Per la preparazione di Celle per citometria a flusso
5 ml Provetta in polistirene a fondo tondo (con 35 µ Tappo a scatto per filtro cellulare M)Corning352235Per la preparazione di cellule per citometria a flusso
Bulbi di gomma da 2 mlFischer Scientific03-448-24
Vetro borosilicato da 9" non collegato Pipette PasteurBioExpressP-2904-2
0,65 ml Provette per microcentrifuga, graduate, verdiGeneMateC-3259-G
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml, graduate, rossoGeneMateC-3260-R
TC20 contatore di cellule automatizzatoBioRad145-0102
Vetrini di conteggio per TC20BioRad145-0011
pozzetti Piastra trattata per colture tissutali a fondo piattoCorning353046
Siringhe da 20 ml BDPlastipak300613Per la sterilizzazione con filtro di aliquote
Filtri per siringhe sterili, 0,2 & micro; m polietersulfoneVWR28145-501Per la sterilizzazione del filtro di aliquote
250 ml Sistema di filtraggio, 0,22 &; micro; m polietersulfone, sterilizzante, a basso legameCorning431096Per la sterilizzazione con filtro di mezzi sfusi
Sistema di filtraggio da 500 ml, 0,22 &; m polietersulfone, sterilizzante, a basso legameCorning431097Per la sterilizzazione con filtro di terreni
Anticorpi e controlli isotipici
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))Abcamab19615Anticorpo primario
Anti-TNNT2 (clone: 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Anticorpo
primario Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)Sistemi sinaptici310111Anticorpo primario
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)AbcamAB131661Anticorpo
primario Anti-IRX4   BiossBS-9464RAnticorpo primario
Alexa Fluor 488 Capra anti-topo IgG1 Life TechnologiesA21121Anticorpo secondario
Alexa Fluor 647 Capra anti-topo IgG2aLife TechnologiesA21241Anticorpo secondario
Alexa Fluor 488 Capra anti-topo IgG2bLife TechnologiesA21141Anticorpo secondario
Ficoeritrina (PE) Capra anti-coniglio IgGR& D SystemsF0110Anticorpo secondario
di topo IgG1BD Biosciences557273Controllo dell'isotipo
di topo IgG2aeBiosciences16-4724-81Controllo dell'isotipo
IgG-PE di coniglioR& D SystemsIC105PIsotype Control
TaqMan Probesets per qRT-PCR
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Life TechnologiesHs00158126
MESP1Life TechnologiesHs01001283
MYH11 (SMMHC)Life TechnologiesHs00224610
MYH6Life TechnologiesHs01101425
MYL2 (MLC2v)Life TechnologiesHs00166405
MYL7 (MLC2a)Life TechnologiesHs01085598
MYOGLife TechnologiesHs01072232
NKX2.5Life TechnologiesHs00231763
NPPALife TechnologiesHs01081097
POU5F1Life TechnologiesHs04260367
SOX17Life TechnologiesHS00751752
TNNI1Life TechnologiesHS00913333
TNNI2Life TechnologiesHS00268536
TNNI3Life TechnologiesHS00165957
TNNT2Life TechnologiesHS00165960
Soluzione per il 6 sfusi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al.

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Cardiomyocyte DifferentiationPluripotent Stem CellsFlow CytometryCardiac Troponin IIRX4 MarkerMLC2v MarkerMLC2a MarkerTNNT2 MarkerStem Cell CultureAntibody Staining

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