El implante de gel de fibrina en pulmón de ratón para el Estudio de la angiogénesis pulmón específico

Summary

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Abstract

Los recientes avances significativos en las técnicas de investigación de células madre y de bioingeniería han hecho grandes progresos en la utilización de biomateriales para regenerar y reparar daños en los tejidos simples en los campos de ortopedia y periodontales. Sin embargo, los intentos para regenerar las estructuras y funciones de los órganos (3D) más complejos tridimensionales tales como pulmones no han tenido mucho éxito debido a que los procesos biológicos de la regeneración de órganos no han sido bien explorados. Se está haciendo evidente que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña un papel clave en la regeneración de órganos. Recién formado vasculatures no sólo entregar el oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares que se requieren para la regeneración de órganos, pero también proporcionan señales instructivas para la regeneración de los tejidos locales. Por lo tanto, para regenerar con éxito pulmones en un adulto, es necesario recapitular los microambientes-pulmón específico en el que la angiogénesis unidades de regeneración de los tejidos pulmonares locales. Aunque conventional in vivo ensayos de angiogénesis, tales como la implantación subcutánea de la matriz extracelular (ECM) ricos en hidrogeles (por ejemplo, fibrina o colágeno o geles de Matrigel – mezcla de proteínas ECM secretada por las células del sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm ratón), se utilizan ampliamente para explorar la mecanismos generales de la angiogénesis, la angiogénesis pulmonar específica no ha sido bien caracterizado porque los métodos para la implantación ortotópica de los biomateriales en el pulmón no han sido bien establecidos. El objetivo de este protocolo es introducir un método único para implante de gel de fibrina en la superficie de pulmón de vivir ratón adulto, lo que permite la recapitulación exitosa de anfitrión angiogénesis pulmonar derivado en el interior del gel. Este enfoque permite a los investigadores a explorar los mecanismos por los que el microambiente-pulmonar específica controla la angiogénesis y la regeneración alveolar en condiciones normales y patológicas. Desde el lanzamiento biomateriales implantados y suministrar señales físicas y químicas a l adyacentetejidos ung, la implantación de estos biomateriales en pulmón enfermo potencialmente pueden normalizar los tejidos enfermos adyacentes, permitiendo a los investigadores a desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares.

Introduction

El objetivo general de este protocolo es la introducción de un método para implantar gel de fibrina en la superficie del pulmón de ratón adulto, que permite a los investigadores caracterizar los mecanismos moleculares de vascular pulmonar y el desarrollo alveolar y aprovechar este conocimiento para desarrollar materiales biomiméticos capaz de recapitular vascular pulmonar fisiológica y la formación alveolar para tratar diversas enfermedades pulmonares.

Más de 35 millones de estadounidenses sufren de enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis pulmonar. Estos pacientes tienen síntomas de larga duración crónicas respiratorias como dificultad para respirar, opresión en el pecho, tos persistente y cansancio, que deterioran significativamente su vida diaria ^1-3. A pesar de una gran cantidad de esfuerzo para desarrollar terapias eficaces para estas enfermedades de los pulmones, en la actualidad no existe una cura; Por lo tanto, la calidad de vida de estos pacientes es pobre y económica y los costos humanos son high ^4-7. En la actualidad, el trasplante de pulmón es la única manera de salvar a los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas en fase terminal. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de trasplante, de alto costo, complicaciones graves, y la baja tasa de supervivencia ^8-11, el trasplante no es un enfoque óptimo. Rápidos progresos recientes en las técnicas de ingeniería de tejidos ha permitido a los investigadores bioingeniería pulmón implantable por repoblar descelularizado pulmonar completo con varios tipos de células progenitoras o células madre pluripotentes inducidas (iPS) células ^12,13. Sin embargo, estos pulmones bioingeniería son funcionales en animales huéspedes sólo durante varias horas después ^12,14,15 implantación. Utilizando biomateriales para regenerar las complejas estructuras y funciones de los pulmones ha sido también bastante éxito. Esto puede deberse a que los procesos biológicos fundamentales que rigen la regeneración pulmonar de adultos no han sido bien explorado. En el pulmón, la formación del sistema vascular es uno de los acontecimientos más tempranos y más importantes duriel desarrollo y la regeneración ^16-21 ng. Vasculaturas recién formado en el pulmón no sólo entregar oxígeno, nutrientes y diversos componentes celulares necesarios para la formación de órganos, sino que también proporcionan señales reguladoras instructivos a las células circundantes ^22-25. Por lo tanto, la angiogénesis juega un papel clave en alveolarization regenerativa en pulmones adultos ^24,26,27. Además, la angiogénesis desregulada contribuye a enfermedades pulmonares crónicas, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ^28, la displasia broncopulmonar (DBP) ^21-23, y fibrosis pulmonar ^29. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la ingeniería de los pulmones o el tratamiento de enfermedades pulmonares crónicas, es necesario comprender los mecanismos fundamentales de la angiogénesis pulmonar específica.

Cada órgano muestra las propiedades mecánicas y químicas únicas, que pueden diferir entre las condiciones fisiológicas y patológicas ^30-33. Estos microenviron órgano-específicamentos regulan los comportamientos de las células endoteliales y orquestan formación de la red vascular de una manera específica de órgano ^24,34-36. Por lo tanto, para desarrollar estrategias más eficientes para la regeneración de pulmón, el mecanismo subyacente a la angiogénesis pulmonar específica necesita ser entendido. Mientras ensayos de angiogénesis in vivo convencionales tales como la implantación subcutánea de hidrogel se han utilizado ampliamente para la investigación de la angiogénesis ^37-39, esos métodos no recapitulan la angiogénesis específico de órgano. Recientemente, un nuevo método para implantar Matrigel en un molde elástico en el pulmón de ratón ha sido desarrollado y demostrado con éxito para reclutar vasos sanguíneos y células epiteliales del pulmón en los geles ^22. Este enfoque único permitirá a los investigadores explorar el mecanismo de la angiogénesis-pulmón específico, así como las interacciones entre los vasos sanguíneos y las células pulmonares no vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas. Desde 1) Matrigel no es adecuado para la aplicación clínica; 2) el correomolde lastic utilizado para lanzar el gel puede afectar a las interacciones entre los hidrogeles y tejido pulmonar anfitrión y 3) el molde elástico en el pulmón potencialmente causa un deterioro de la función pulmonar y el dolor durante la respiración, como un enfoque más clínicamente relevante, una matriz de fibrina 3D que contiene factores angiogénicos (factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) / factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)) ha sido implantado en el pulmón de ratón sin poner en el molde elástico, y se ha recapitulado éxito anfitrión angiogénesis pulmonar derivados. Gel de fibrina, fibrillas de polímeros generados a partir de fibrinógeno escindido por trombina, es conocido para atrapar una variedad de factores angiogénicos como bFGF y VEGF para acelerar la angiogénesis in vivo ^40,41. Debido a su capacidad regenerativa y la naturaleza biodegradable ^42, gel de fibrina se utiliza ampliamente en el campo de la ingeniería de tejidos.

Este artículo presenta un enfoque novedoso y único para implante de gel de fibrina en la superficie pulmonar de adult vivirt ratón y demuestra que anfitrión angiogénesis pulmonar derivado se recapitula el interior de los geles en vivo. Este método, que permite a los investigadores estudiar la angiogénesis pulmonar específica, es probable que conduzca al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para varios tipos de enfermedades pulmonares y avanzar significativamente los esfuerzos para regenerar con éxito pulmón adulto.

Protocol

NOTA: El estudio in vivo en animales se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo del Hospital Infantil de Boston (Números de Protocolo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Todos los fármacos utilizados en este protocolo son de grado farmacéutico y estos medicamentos se preparan en condiciones estériles. <p c…

Representative Results

Para examinar si la formación vascular anfitrión de pulmón derivado se recapitula en el interior de los biomateriales implantados en el pulmón, geles de fibrina complementan con gran factores angiogénicos VEGF y bFGF (0, 10 y 100 ng / ml cada uno) fueron implantados en la superficie de la que viven los pulmones del ratón como informó utilizando Matrigel 22. Los geles de fibrina 47 que contienen estos factores de crecimiento angiogénicos se fabricaron como se muestra en la Figura 1a….

Discussion

Este artículo presenta un nuevo método para implantar biomateriales en la superficie de pulmón de vida del ratón adulto. Con este sistema, la angiogénesis derivada de pulmón de acogida se recapitula con éxito dentro del material. Este sistema permite a los investigadores a explorar la diafonía entre las células endoteliales, otras células (por ejemplo, células epiteliales, células mesenquimales, células inmunes) y diversos componentes de ECM que son necesarios para la angiogénesis local de ^50…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fibrinogen from human placenta	Sigma	F4883	For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164	R&D	493-MV	For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF	R&D	3139-FB	For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific INC	RIS 100	For intubation
Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12-565-35	For intubation
20G Elastic catheter	B.Braun	4251652-02	For intubation
MiniVent Ventilator	Harvard Apparatus	CGS-8009	For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope	Fisher Scientific	12-070-515	For surgey
Absobable suture	Ethicon	PDP304	Surgical suture
Antibody against CD31	BD Biosciences	553370	Immunohistochemistry
Antibody against AQP5	Abcam	AB78486	Immunohistochemistry
Antibody against SP-B	Millipore	AB40876	Immunohistochemistry