Implantation av fibringel på Mus Lung att studera Lung specifika angiogenes

Summary

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Abstract

Nya betydande framsteg inom stamcellsforskning och bioteknik tekniker har gjort stora framsteg i att utnyttja biomaterial att regenerera och reparera skador i enkla vävnader i ortopediska och parodontala fält. Men försök att regenerera de strukturer och funktioner mer komplexa tredimensionella (3D) organ som lungor har inte varit mycket framgångsrik eftersom de biologiska processerna i organregenerering inte har väl utforskat. Det blir tydligt att angiogenes, bildandet av nya blodkärl, spelar nyckelroller i organregenerering. Nybildade vasculatures inte bara leverera syre, näringsämnen och olika cellkomponenter som krävs för organregenere men också ge instruktiva signaler till de regenererande lokala vävnader. Därför att framgångsrikt regenerera lungorna i en vuxen, är det nödvändigt att rekapitulera lungspecifika mikromiljöer där angiogenes enheter regenerering av lokala lungvävnader. Även conventional in vivo angiogenes analyser, såsom subkutan implantation av extracellulär matris (ECM) -rika hydrogeler (t.ex., fibrin eller kollagengeler eller Matrigel – ECM proteinblandning som utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller), är i stor utsträckning används för att utforska generella mekanismer för angiogenes, lungspecifika angiogenes har inte väl karakteriserade eftersom metoder för orthotopic implantation av biomaterial i lungan inte har väl etablerade. Målet med detta protokoll är att införa en unik metod för att implantera fibringel på lungytan levande vuxen mus, vilket möjliggör en framgångsrik rekapitulation av värd lung-derived angiogenes inne gelen. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att undersöka de mekanismer genom vilka lungan specifika mikromiljö kontrollerar angiogenes och alveolär förnyelse i både normala och patologiska tillstånd. Eftersom implanterade biomaterial release och leverera fysikaliska och kemiska signaler till intilliggande lUNG vävnader, kan implantation av dessa biomaterial på sjuka lungan potentiellt normalisera de intilliggande sjuka vävnader, som gör det möjligt för forskare att utveckla nya behandlingsmetoder för olika typer av lungsjukdomar.

Introduction

Det övergripande målet med detta protokoll är att införa en metod för att implantera fibringel på lungytan vuxen mus, vilket gör det möjligt för forskarna att karakterisera de molekylära mekanismerna för lung vaskulära och alveolär utveckling, och för att utnyttja denna kunskap för att utveckla biomimetiska material kapabla av rekapitulera fysiologisk lungkärl och alveolär formation för att behandla olika lungsjukdomar.

Mer än 35 miljoner amerikaner lider av kroniska lungsjukdomar, inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom och lungfibros. Dessa patienter har långvariga kroniska luftvägssymtom såsom andnöd, tryck över bröstet, tjat hosta och trötthet, som avsevärt inskränker deras dagliga liv ^1-3. Trots en stor mängd arbete med att utveckla effektiva behandlingar för dessa lungsjukdomar, för närvarande finns det inget botemedel; Därför är dålig och ekonomiskt livskvaliteten för dessa patienter och mänskliga kostnaderna är high ^4-7. För närvarande är lungtransplantation det enda sättet att rädda patienter med gravt kronisk lungsjukdomar. Men på grund av bristen på transplantationsdonatorer, höga kostnader, allvarliga komplikationer, och låg överlevnad ^8-11, är transplantation inte ett optimalt förhållningssätt. Senaste snabba framsteg inom vävnadsingenjörsteknik har gjort det möjligt för forskare att bioengineer implanterbar lungan genom återinplantering decellulariserad hela lungan med olika typer av stamceller eller inducerade pluripotenta stam (iPS-celler) ^12,13. Men dessa bioengineered lungor är funktionella i värddjur endast under flera timmar efter implantation ^12,14,15. Använda biomaterial att regenerera de komplexa strukturer och funktioner hos lungor har också varit ganska misslyckat. Detta kan bero på att viktiga biologiska processer som styr vuxen lung förnyelse inte har väl utforskat. I lungan, är en av de tidigaste och viktigaste händelserna duri bildningen av kärlsystemetng utveckling och förnyelse ^16-21. Nybildade vasculatures i lungan inte bara leverera syre, näringsämnen och olika cellkomponenter som krävs för organbildning, men också ge instruktiva regulatoriska signaler till omgivande celler ^22-25. Således spelar angiogenes nyckelroller i regenerativ alveolarization hos vuxna lungor ^24,26,27. Dessutom bidrar avreglerad angiogenes till kroniska lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) ^28, bronkopulmonell dysplasi (BPD) ^21-23, och lungfibros ^29. Således, för att utveckla effektivare strategier för ingenjörs lungorna eller behandla kroniska lungsjukdomar, är det nödvändigt att förstå de grundläggande mekanismerna för lungspecifika angiogenes.

Varje orgel visar unika mekaniska och kemiska egenskaper, som kan skilja mellan fysiologiska och patologiska tillstånd ^30-33. Dessa organspecifika microenvironment reglerar endotel beteenden och orkestrera vaskulär nätverksbildning i ett organ specifikt sätt ^24,34-36. Således, för att utveckla effektivare strategier för lung regeneration, mekanismen bakom lungspecifika angiogenes måste förstås. Medan konventionella in vivo angiogenes analyser såsom subkutan hydrogel implantation har använts i stor utsträckning för angiogenes forskning ^37-39, gör dessa metoder inte rekapitulera organspecifika angiogenes. Nyligen har en ny metod för att implantera Matrigel i en elastisk mögel på muslunga utvecklats och visat att framgångsrikt rekrytera blodkärl och lungepitelceller i gelerna ^22. Denna unika metod gör det möjligt för forskare att undersöka mekanismen av lungspecifika angiogenes och samspel mellan blodkärl och icke-vaskulära lungceller i fysiologiska och patologiska tillstånd. Sedan 1) Matrigel är inte lämplig för klinisk tillämpning; 2) eLastic mögel används för att gjuta gelen kan påverka samspelet mellan hydrogeler och värdlungvävnad och 3) den elastiska mögel på lungan orsakar potentiellt nedsatt lungfunktion och smärta vid andning, som ett mer kliniskt relevant strategi, en 3D fibrin matris innehållande angiogena faktorer (vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) / basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF)) har implanterats på muslungan utan gjutning i den elastiska formen, och har framgångsrikt rekapituleras värd lunga härrörande angiogenes. Fibringelen, polymer fibriller genererade från trombin-kluvna fibrinogen, är känd för att fånga en mängd olika angiogena faktorer såsom bFGF och VEGF att påskynda angiogenes in vivo ^40,41. På grund av dess regenerativ förmåga och bionedbrytbara natur ^42, är fibringel ofta används inom området för vävnadsteknik.

Denna artikel införs ett nytt och unikt sätt att implantera fibringel på lungytan levande adult mus och visar att värd lung-derived angiogenes rekapituleras inuti geler in vivo. Denna metod, som gör det möjligt för forskare att studera lungspecifika angiogenes, sannolikt kommer att leda till utveckling av nya behandlingsmetoder för olika typer av lungsjukdomar och betydligt vidare ansträngningar för att framgångsrikt regenerera vuxen lunga.

Protocol

OBS: in vivo djurstudie genomfördes i strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Protokollet har granskats och godkänts av Animal Care och användning kommittén i Boston Barnsjukhus (Protokoll Numbers: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Alla läkemedel som används i detta protokoll är farmaceutisk kvalitet och dessa läkemedel bereds under sterila förhållanden. 1. fibringel Framställning F…

Representative Results

För att undersöka huruvida värd lunga härrörande kärlbildning rekapituleras innanför biomaterialen implanteras på lungan, fibringeler kompletterat med större angiogen faktorer VEGF och bFGF (0, 10 och 100 ng / ml vardera) implanterades på ytan av levande muslungor som rapporteras med Matrigel 22. Fibringeler 47 som innehåller dessa angiogena tillväxtfaktorer tillverkades såsom visas i fig 1a. Efter torakotomi, var ett litet område av den vänstra lungan ytan skrapas m…

Discussion

Denna artikel introducerar en ny metod för att implantera biomaterial på lungytan levande vuxen mus. Med detta system är värd lung-derived angiogenes framgångsrikt rekapituleras inuti materialet. Detta system gör det möjligt för forskare att utforska överhörning mellan endotelceller, andra celler (t.ex., epitelceller, mesenkymala celler, immunceller) och olika ECM-komponenter som krävs för lokal angiogenes ^50-53 och alveolär regenere ^24,54. Även konventionella in vivo</em…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fibrinogen from human placenta	Sigma	F4883	For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164	R&D	493-MV	For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF	R&D	3139-FB	For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific INC	RIS 100	For intubation
Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12-565-35	For intubation
20G Elastic catheter	B.Braun	4251652-02	For intubation
MiniVent Ventilator	Harvard Apparatus	CGS-8009	For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope	Fisher Scientific	12-070-515	For surgey
Absobable suture	Ethicon	PDP304	Surgical suture
Antibody against CD31	BD Biosciences	553370	Immunohistochemistry
Antibody against AQP5	Abcam	AB78486	Immunohistochemistry
Antibody against SP-B	Millipore	AB40876	Immunohistochemistry