תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים
Summary
DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.
Abstract
S -Adenosyl-l-מתיונין (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTase) לזרז את העברת הקבוצה מתיל מופעלת מAdoMet לתפקידים מסוימים בדנ"א, רנ"א, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות. תגובת מתילציה טבעית זה יכול להיות מורחב למגוון רחב של תגובות אלקילציה באמצעות אנלוגים cofactor סינטטיים. החלפה של מרכז sulfonium תגובה של AdoMet עם טבעת aziridine מובילה לקו-פקטורים שיכולים להיות בשילוב עם ה- DNA על ידי MTases DNA השונים. יכול להיות מצויד קו-פקטורי aziridine אלה עם קבוצות כתב בעמדות שונות של מחצית אדנין ומשמשים לM equence הספציפי S ethyltransferase- אני nduced ing הבל L של DNA (DNA מחייך). כדוגמא טיפוסית שאנו נותנים לפרוטוקול biotinylation של פלסמיד דנ"א pBR322 ברצף 5'-ATCG 'T-3 עם DNA MTase M.BseCI והקו-פקטורי aziridine 6BAz בצעד אחד. סיומת של קבוצה מתיל מופעלת עם תוצאות קבוצות אלקיל בלתי רוויות בסוג אחר של אנלוגים AdoMet המשמשים לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups ctivated G (mTAG). הואיל וצד הרשתות המורחבות מופעלות על ידי מרכז sulfonium וקשר בלתי רווי, קו-פקטורים אלה נקראים אנלוגים AdoMet כפולים הופעלו. אנלוגים אלה לא רק פונקציה כקו-פקטורים לMTases DNA, כמו הקו-פקטורי aziridine, אלא גם לRNA, חלבונים וMTases מולקולה קטנה. הם משמשים בדרך כלל לשינוי האנזימטית של מצעי MTase עם קבוצות פונקציונליות ייחודיות אשר כותרתו עם קבוצות כתב בצעד כימי שני. זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לתיוג הקרינה חלבון היסטון H3 של. קבוצת propargyl קטנה מועברת מSeAdoYn האנלוגי cofactor לחלבון על ידי ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ואחריו תיוג לחיצהH3 היסטון alkynylated עם אזיד טמרה. תיוג בתיווך MTase עם אנלוגים cofactor הוא טכנולוגיה המאפשרת ליישומים מרגשים רבים כוללים זיהוי ומחקר פונקציונלי של מצעי MTase כמו גם genotyping DNA וגילוי מתילציה.
Introduction
תיוג ספציפי של חומצות גרעין וחלבוני 1,2 3,4 הוא עניין גדול לאפיונים פונקציונליים, אבחון רפואי וביוטכנולוגיה (ננו). כאן אנו מציגים שיטת תיוג האנזימטית לbiopolymers אלה המבוסס על -adenosyl-l-מתיונין S (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTases). המעמד הזה של אנזימים (EC 2.1.1.) מיועד לעמדות פרט nucleophilic (חנקן, חמצן, גופרית ואטומה פחמן) בתוך שאריות ספציפיות של חומצות גרעין וחלבונים ובאופן טבעי מעביר את הקבוצה מתיל מופעלת של AdoMet cofactor (איור 1 א) 5. בנוסף, MTases יכול לנצל אנלוגים cofactor סינטטיים לתיוג ספציפי עם תגי זיקה, fluorophores או תוויות אחרות (איור 1) 6. שתי כיתות של אנלוגים AdoMet פותחו: קו-פקטורי Aziridine לי ethyltransferase- M S equence ספציפי </strong> הבל nduced L ing (מחייך) 7 ואנלוגים כפולים מופעלים AdoMet לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups G ctivated (mTAG) 8.
איור 1: תגובות זרזו ידי methyltransferases (MTases) העברת א תיל קבוצה מהקו-הפקטורים הטבעיים AdoMet (SAM) למצעים שונים, כולל DNA, RNA, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות B. התיוג / functionalization של חומצות גרעין וחלבונים (לעדכונו =.. זוגות בסיסים לDNA, נוקלאוטידים לחומצות אמינו RNA וחלבונים; XXXXX = רצף הכרה בMTase עם שאריות יעד בירוק) עם אנלוגים cofactor סינטטיים. קו-פקטורי Aziridine המכילים קבוצת כתב (כדור הכחול)מצורף לטבעת אדנין הם הרצף במיוחד בשילוב עם שאריות היעד (משמאל) ואנלוגים מופעלים כפולים AdoMet להוביל להעברת חלק מרשתות אלקיל הוארכו ביצוע Y כתב כימי (מימין) שיכול להיות מתויג בתגובה לחץ bioorthogonal בשלב שני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קו-פקטורי Aziridine יעבדו הכי טוב עם MTases DNA. הם מכילים טבעת membered שלוש עם אטום חנקן 9 (או N -mustard 10,11) במקום מרכז sulfonium קבוצה תגובתי כ. Protonation של אטום חנקן זה מפעיל את טבעת aziridine להתקפת nucleophilic ידי נוקלאוטיד היעד שמוביל לקוולנטיים צימוד של כל הקו-הפקטור עם DNA. על ידי הצמדת קבוצות כתב לטבעת אדנין הקו-פקטורי aziridine ניתן להשתמש בשילוב עם MTases DNA לתייג DNA בשלב אחד ( <stron g> איור 1, משמאל) 7,12. זו באה לידי הביטוי בפירוט לbiotinylation של DNA עם 13 6BAz – 15 (קו-פקטור aziridine עם ביוטין מצורף לעמדת 6 של טבעת אדנין) ואדנין הספציפי DNA MTase מstearothermophilus Bacillus (M.BseCI) 16 (איור 2, ראה פרוטוקול סעיף 2: תיוג צעד אחד של DNA באמצעות aziridine קו-פקטורים). בנוסף לM.BseCI ("רצף ההכרה, MTases DNA מThermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG -3 5'-ATCG T-3)"), מheamolyticus Haemophilus (M.HhaI, 5 "-G C GC-3 ') ומספירופלסמה (M.SssI, 5'- C G-3") שימשו בהצלחה לbiotinylate DNA עם 6BAz 17. יתר על כן, יכול להיות מועסק קו-פקטורי aziridine לתיוג DNA הקרינה צעד אחד 18,19.
ontent "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד ">
איור 2:. Biotinylation צעד אחד ספציפי רצף של DNA עם M.BseCI ו6BAz DNA MTase M.BseCI מכיר את רצף פעמיים תקועים DNA 5'-ATCG T-3 "ובאופן טבעי methylates קבוצת אמינו של אדנין השני שאריות (ירוק) באמצעות AdoMet. עם הקו-פקטור aziridine 6BAz במהלך התגובה משתנה וM.BseCI מוביל לרצף biotinylation DNA הספציפי על ידי צימוד כל cofactor כולל ביוטין (כחול) עם אדנין היעד. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנלוגים AdoMet מופעלים זוגי מכילים הוארכו שרשרות צד בלתי רוויות במקום קבוצה מתיל במרכז sulfonium (איור 1 </strong>, מימין) 20. הקשר כפול או משולש בלתי רווי בβ-עמדה למרכז sulfonium אלקטרוני מפצה אפקטים סטרית שליליים בתוך מדינת המעבר על ידי ייצוב conjugative. מאחר ששני מרכז sulfonium והקשר בלתי רווי להפעיל את שרשרת הצד להעברה האנזימטית, הקו-הפקטורים הללו בשם אנלוגים AdoMet כפול הופעלו. בדרך כלל, הם משמשים להעברת רשתות בצד עם קבוצות ייחודיות כימיות (כתבים כימיים), כמו קבוצות אמינו, alkyne ויזיד, לתיוג הכימותרפיה סלקטיבי בשלב שני 8,21. באופן כללי, אנלוגים מופעלים כפולים AdoMet לא יכולים לתפקד רק כקו-פקטורים לDNA MTases 8,20,21 אלא גם לRNA MTases 22,23 וMTases חלבון 24-28 המאפשרים תיוג נוסף של RNA וחלבונים. עם זאת, בצד הרשתות המורחבות הן sterically תובעניים יותר מקבוצה מתיל והרחבת האתרים הפעילים MTase על ידי חלבון הנדסה היא לעתים קרובותen נדרש כדי להשיג קצבי העברה יעילה. פתרון נוסף לבעיה זו הוא להשתמש אנלוגי AdoMet עם קבוצה קטנה propargyl (שלושה פחמנים) שבו alkyne המסוף משרת שתי פונקציות: 1. ייצוב של מצב המעבר בעת ההעברה האנזימטית ו2. ידית תגובה לשינויים כימיים הבאים על ידי נחושת cycloaddition אזיד-alkyne זרז (CuAAC) לחץ כימיה. התברר כי propargylic כתוצאה האנלוגית AdoMet 29 הוא די יציב בתנאים ניטראליים או מעט בסיסיים ושימוש מוגבל בלבד. חסרון זה יכול להיות קבוע על ידי החלפת אטום הגופרית עם סלניום. הקו-פקטור תוצאת 5 '- [(Se) [(3 S) -3-אמינו-3-carboxypropyl] אבזר-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosine (SeAdoYn, איור 3) מתקבל על ידי DNA wild-type, RNA וMTases חלבון 30-32 שיבטלו את הצורך בהנדסת חלבונים במקרים רבים. זה בא לידי ביטוי על ידי הקרינה פרו תיוג חלבון עם ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (איור 3, ראה סעיף פרוטוקול 3: תיוג חלבון שני שלבים באמצעות קו-פקטורים כפולים מופעלים).
איור 3:. תיוג הקרינה שני שלבי רצף ספציפי של היסטון H3 עם Set7 / 9, אזיד SeAdoYn וטמרה החלבון MTase Set7 / 9 באופן טבעי methylates קבוצת אמינו של ליזין 4 בH3 היסטון (H3K4, הירוקה) באמצעות AdoMet. עם הקו-הפקטור מופעל הכפול SeAdoYn MTase מעביר קבוצה קטנה propargyl (אדום) לשאריות ליזין. הקשר משולש, המסוף המצורף מכן שונו באופן סלקטיבי בתגובת לחץ bioorthogonal (cycloaddition אזיד-alkyne-זרז נחושת, CuAAC) עם (tetramethylrhodamine, כחול) fluorophore-derivatized אזיד טמרה.עומס / 52,014 52014fig3highres.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
תיוג צעד אחד של DNA עם MTases DNA וקו-פקטורי aziridine (DNA מחייך) הוא שיטה חזקה אבל כמה היבטים יש לשקול בעת תכנון הניסוי.
קו-פקטור Aziridine: ריכוז 6BAz לתיוג DNA עם M.BseCI היה 60 מיקרומטר. בעת השימוש בMTases DNA האחר ריכוז הקו-הפקטור צריך להיות מותאם, ריכו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
Riferimenti
- Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -. W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -. W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. , (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -. G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -. P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
