الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
تدهور البروتين من قبل النظام اليوبيكويتين-بروتوزوم (UPS) هو آلية تنظيمية رئيسية لتوازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. المنهج المعياري لتحديد تدهور البروتين داخل الخلايا يعتمد على فحوصات البيوكيميائية لمتابعة حركية انخفاض البروتين. مثل هذه الأساليب غالبا ما تكون شاقة وتستغرق وقتا طويلا وبالتالي غير قابلة للتجارب تهدف إلى تقييم ركائز متعددة، وتدهور الأوضاع. كبديل، تم إعداد المقايسات المعتمدة على نمو الخلايا، التي هي، في الشكل التقليدي، المقايسات نقطة النهاية التي لا يمكن تحديد كميا التغيرات النسبية في مستويات البروتين.
نحن هنا تصف طريقة التي يحدد بأمانة التغيرات في معدلات تدهور البروتين اقتران لهم الخميرة خلية حركية النمو. وتستند هذه الطريقة على نظام اختيار أنشئت حيث -deleted اليوراسيل auxotrophy من URA3 هو انقاذ خلايا الخميرة عن طريق البروتين مراسل أعرب خارجيا، تتألف من مزيج بين الجينات URA3 أساسيا ومحددا تدهور (degron). تم تصميم هذا البروتين مراسل بحيث معدل تخليق لها هو ثابت في حين يتم تحديد معدل التدهور من قبل degron. كما نمو الخلايا في واليوراسيل نقص المتوسطة يتناسب مع المستويات النسبية للUra3، حركية النمو تعتمد كليا على تدهور البروتين المراسل.
هذه الطريقة يقيس بدقة التغيرات في الخلايا الحركية تدهور البروتين. تم تطبيقه على: (أ) تقييم المساهمة النسبية للعوامل التصريف اليوبيكويتين المعروف أن التحلل البروتيني (ب) E2 انزيم التصريف هيكل وظيفة تحليلات (ج) تحديد وتوصيف degrons الرواية. تطبيق نظام URA3 المستندة degron- يتجاوز مجال تدهور البروتين، كما يمكن أيضا أن تتكيف مع التغييرات رصد مستويات البروتين المرتبط ظائف مسارات الخلوية الأخرى.
Introduction
نظام تدهور اليوبيكويتين-بروتوزوم هو آلة التنظيمية الرئيسية، والتي تورطت في الحفاظ على توازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. يو بي إس تقارن البداية جزيئات اليوبيكويتين متعددة لبروتين بعد الهدف الذي تتدهور البروتين بولي اليوبيكويتين الموسومة من قبل بروتوزوم 26S. في معظم الحالات، فإن معدل الحد خطوة لاليوبيكويتين بوساطة التحلل هو الركيزة ubiquitylation بوساطة E2 التصريف الإنزيمات والإنزيمات E3 ligating (E3 Ligases) 1. بالتالي، الاستقرار داخل الخلايا بروتينات معينة تعكس قابليتها للاليوبيكويتين-الاقتران ونشاط الانزيمات وما شابه ذلك ubiquitylation بهم.
ligases E3 هي مكونات التعرف على الركيزة الرئيسية لشركة يو بي إس. على هذا النحو، وهذه الانزيمات تعترف degrons ضمن الركائز التي هي إما غائبة أو لم تتعرض في نظرائهم مستقرة 2. على سبيل المثال، العديد من المنظمين دورة الخلية مأوست يتم توليفها وتدهورت بطريقة محددة زمنيا من أجل الحفاظ على تقدم دورة الخلية في النظام. وغالبا ما تسيطر على تدهور هذه البروتينات من خلال الفسفرة، بوساطة الخلايا، مما يشير إلى تحركات التنظيم 3،4. من ناحية أخرى، يتم التعرف على البروتينات مطوية aberrantly من خلال degrons خفي. وهذه هي المناطق التي تكون مخفية عادة في البنية الأصلية ويتعرضون على هيكل الاضطراب. وتشمل مجالات مثل degrons مسعور 5-7 وشرائح المختلين جوهريا 8.
منذ اكتشاف المنوي للنظام اليوبيكويتين لتدهور البروتين وتوصيف العوامل الأساسية في الخلايا الشبكية 9 لست]، وكانت الوراثة الخميرة مفيدة في اكتشاف العديد من مكونات النظام اليوبيكويتين 10. هو نجاح الخميرة كما كائن نموذج لتحليل منهجي من تدهور البروتين من قبل شركة يو بي إس يرجع ذلك أساسا إلى كون يو بي إس هي عاليةلاي المحفوظة في جميع حقيقيات النوى 4، إلى جانب قابليته على كنظام تجريبي. في الواقع، وتستخدم النظم القائمة على الخميرة عادة إلى فك آليات عمل آلية ubiquitylation.
دراسة تحلل البروتين عن طريق البيوكيميائية وعادة ما يتطلب إعداد مقتطفات الخلية. بينما بروتينات الخلية الحيوانية يمكن استخراجه تحت ظروف معتدلة نسبيا التي تحافظ على تفاعلات البروتين وظيفة، وجود جدار الخلية قوية في الخميرة 11 يتطلب أقسى بكثير الظروف التي قد تؤثر على تعطيل الانتعاش البروتين. في الواقع، وإجراءات مختلفة لتعطيل خلية الخميرة تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها على استعادة بروتينات سليمة في المبالغ التي تمثل الوفرة النسبية الخلوية الخاصة بهم بشكل صحيح. مزيد من الدقة متأصلة في الطرق المختلفة المستخدمة لتحديد معدلات تدهور للبروتينات محددة: تجارب "نبض مطاردة" الاستقلابية القائم على العلامات تليها ايمmunoprecipitation، لعزل بروتينات معينة 12، في كثير من الأحيان لا الكمية بدقة. وبالتالي، عندما تتم مقارنة تدهور البروتين بواسطة هذه الطريقة، ينبغي توخي الحذر في تفسير النتائج. للتحايل على هذا العيب، وهو سيكلوهيكسيميد البديل (فروج) مطاردة الفحص ويمكن استخدام 12. في هذا الاختبار، يتم إضافة مثبط الترجمة إلى مزارع الخلايا والتغيرات الزمانية في مستويات بروتين ثابت للدولة يتم رصدها في وقت لاحق. ومع ذلك، فإن استخدام فروج يقتصر على البروتينات مع عمر نصف قصيرة نسبيا (<90 دقيقة)، وكبت طويل الأجل لتخليق البروتين السامة للخلايا. والجدير بالذكر أن كلا من المقايسات المذكورة أعلاه تتطلب استخدام الأجسام المضادة بروتين معين، والتي ليست متاحة دائما.
للتغلب على هذه القيود التقنية، فقد طور الباحثون العديد من الأساليب التي لا تتطلب استخراج الخلايا والبروتين التعامل المباشر. ويستند نهج واحد بشأن إنشاء نعم العوز الغذائيسلالات الواحد، التي حصلت عليها حذف الجينات التي تكود الإنزيمات الأيضية الأساسية. وتشمل هذه الجينات HIS3، LEU2، LYS2 وTRP1، ترميز الإنزيمات اللازمة لالحيوي من الأحماض الأمينية، فضلا عن URA3 أن يشفر المرصد المغربي للسجون كربوكسيل (Ura3)، وهو إنزيم أساسي من البيريميدين ريبونوكليوتيد الحيوي. وقد Ura3 تستخدم على نطاق واسع في الدراسات تدهور البروتين. في هذه المقايسات والتعبير التأسيسية للUra3 ينقذ نمو الخلايا ura3 في واليوراسيل نقص المتوسطة 13. بالتالي زعزعة استقرار Ura3 من خلال الانصهار من degron يمكن أن يقلل من نمو الخلايا في الحد الأدنى من المتوسط تفتقر اليوراسيل. وقد استخدم هذا الأسلوب في مختلف الدراسات تدهور البروتين، بما في ذلك تحديد تدهور محددات 5، E3 ligases 14 و 15 مساعد عوامل ubiquitylation واكتشاف UPS رواية degrons 16. كل من هذه الأساليب المستخدمة نمو الخلايا على لوحات أجار كما فحص قراءات. ومع ذلك، رانه معيار النمو (الإيجابي / النمو السلبي)، في حين قوية وفعالة، هي في معظمها النوعية وليس الكمية توفير المعلومات التي من المهم لتقييم فعالية وdegron أو المساهمة النسبية لمختلف العوامل تدهور المساعدة.
لذا قمنا بتطوير وتستخدم ناقلات الخميرة وطرق الفحص تمكين التحليل المنهجي والكمي للتدهور البروتين بواسطة URA3 -degron نظام الانصهار. ويستند البروتوكول على الفحص سهلة لمقبض الذي يقيس حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية (GiLS) وعلى الجيل من منحنيات النمو القياسية. وتتميز حركية نمو الخميرة قبل ثلاث مراحل رئيسية – تأخر والأسي (سجل) ومرحلة ثابتة. حساب حركية تكرار الخميرة خلال مرحلة السجل ظل ظروف انتقائية، والتي يتم تحديدها من خلال مستويات التعبير عن Ura3-degron، يوفر متحيز قياس الكمي سو تدهور البروتين. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على قياس ومقارنة معدلات تدهور ركائز UPS متعددة في وقت واحد في سلالات متعددة وتحت ظروف مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا تصف مقايسة على أساس نمو الخلايا لتحديد النسبية معدلات تدهور البروتين، وتسمى "حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية" (GiLS). الفحص GiLS ديها العديد من المزايا: انها بسيطة لإعداد، والحصول على البيانات وتحليل واضح وصريح وهو نموذجي للغاية. وبالتال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Riferimenti
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetica. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
