-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak
Summary
Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.
Abstract
Eiwitafbraak door de ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) is een belangrijk regulerend mechanisme voor proteïne homeostase in alle eukaryoten. De standaard aanpak voor het bepalen van intracellulaire eiwitafbraak vertrouwt op biochemische assays voor het volgen van de kinetiek van eiwit daling. Dergelijke methoden zijn vaak omslachtig en tijdrovend en derhalve niet vatbaar experimenten ter beoordeling van verschillende substraten en afbraakcondities. Als alternatief hebben celgroei gebaseerde testen ontwikkeld die, in hun conventionele formaat eindpunt assays die niet kwantitatief bepalen relatieve veranderingen in eiwitniveaus.
Hier een methode die getrouw bepaalt veranderingen in eiwitafbraak tarieven koppelen ze gistcel-groeikinetiek beschrijven we. De methode is gebaseerd op een vast selectiesysteem waarbij uracil auxotrofie van URA3 -deleted gistcellen wordt gered door een exogeen reportergen expressie, Bestaande uit een fusie tussen de essentiële URA3-gen en een degradatie determinant (degron). De reporter proteïne is ontworpen zodat de synthese constant is terwijl de afbraak wordt bepaald door de degron. Zoals celgroei in uracil-deficiënt medium evenredig met de relatieve niveaus van Ura3, groeikinetiek zijn volledig afhankelijk van de reporter eiwitafbraak.
Deze methode meet nauwkeurig veranderingen in intracellulaire eiwitafbraak kinetiek. Het wordt toegepast op: (a) Bepaling van de relatieve bijdrage van bekende ubiquitine conjugeren factoren proteolyse (b) E2 conjugeren enzym structuur-functie analyse (c) de identificatie en karakterisatie van nieuwe degrons. Toepassing van de degron- URA3 gebaseerde systeem overstijgt het veld eiwitafbraak, als het kan worden aangepast aan het volgen van veranderingen van eiwitten die samenhangen met functies van andere moleculaire processen.
Introduction
De ubiquitine-proteasoom degradatie systeem is een belangrijke regulerende machine, die is betrokken bij het handhaven van homeostase eiwitten in alle eukaryoten. De UPS conjugaten eerst meerdere ubiquitine moleculen aan een doeleiwit waarna de poly-ubiquitine-gemerkt eiwit wordt afgebroken door het 26S proteasoom. In de meeste gevallen, de snelheidsbepalende stap voor ubiquitine gemedieerde afbraak beperkt is substraat ubiquitinering, gemedieerd door conjugeren van enzymen E2 en E3 ligeren enzymen (E3 ligasen) 1. Bijgevolg intracellulaire stabiliteit van eiwitten weerspiegelt hun gevoeligheid voor ubiquitine conjugatie en de activiteit van hun verwante ubiquitinering enzymen.
E3 ligases zijn de belangrijkste componenten substraat erkenning van de UPS. Als zodanig zijn deze enzymen herkennen degrons in hun substraten die ofwel afwezig of niet blootgesteld in de stal 2 tegenhangers. Bijvoorbeeld, veel regulatoren van de celcyclus must worden gesynthetiseerd en afgebroken in een tijdelijk specifieke manier om voortgang van de celcyclus in orde te houden. De afbraak van deze eiwitten wordt vaak geregeld door fosforylering-gemedieerde signaaltransductie gereguleerde kinasen 3,4. Aan de andere kant, zijn afwijkend gevouwen eiwitten herkend door cryptische degrons. Dit zijn gebieden die normaal verborgen in de natieve structuur worden blootgesteld aan structuur verstoring. Dergelijke degrons omvatten hydrofobe domeinen 5-7 en intrinsiek ontvouwen segmenten 8.
Aangezien de rudimentaire ontdekking van het ubiquitine-systeem eiwitafbraak en karakterisering van de fundamenten in reticulocyten-lysaten 9, gist genetica was instrumenteel ontdekken vele componenten van het ubiquitine systeem 10. Het succes van gist als modelorganisme voor systematische analyse van eiwitafbraak door de UPS is vooral te wijten aan het feit dat de UPS hoogly geconserveerd in alle eukaryoten 4, in combinatie met zeer geschikt zijn als een experimenteel systeem. Inderdaad, gist gebaseerde systemen algemeen gebruikt om de werkingsmechanismen van de ubiquitinering machine ontcijferen.
Studeren eiwitafbraak door biochemische middel meestal vereist voorbereiding van cel extracten. Terwijl dierlijke cel eiwitten onder relatief milde omstandigheden dat eiwit interacties en functie behouden kunnen worden geëxtraheerd, de aanwezigheid van een stevige celwand van gist 11 zijn aanmerkelijk zwaardere verstoring voorwaarden eiwit herstel kunnen beïnvloeden. Sterker nog, verschillende procedures voor gistcel verstoring verschillen aanzienlijk in hun mogelijkheden om intacte eiwitten herstellen in hoeveelheden die hun relatieve cellulaire overvloed correct voor te stellen. Verder onnauwkeurigheid is inherent aan de verschillende methoden voor het bepalen afbraaksnelheden van specifieke eiwitten: Metabolisch labelen based 'pulse-chase experimenten van gevolgd door immunoprecipitation, specifieke eiwitten 12 isoleren, is vaak niet strikt kwantitatief. Dus, als afbraak van eiwitten wordt vergeleken met deze methode, extra voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van de resultaten. Om dit nadeel te omzeilen, kan een alternatief cycloheximide (CHX) chase assay worden gebruikt 12. In deze test wordt de vertaling inhibitor toegevoegd aan celculturen en temporele veranderingen in eiwit steady-state niveaus worden vervolgens gecontroleerd. Niettemin is het gebruik van CHX beperkt tot eiwitten met relatief korte halfwaardetijden (<90 min), de inhibitie van de eiwitsynthese langdurige cytotoxisch. Met name beide bovengenoemde assays vereisen het gebruik van eiwit-specifieke antilichamen, die niet altijd beschikbaar zijn.
Om deze technische beperkingen te overwinnen, hebben de onderzoekers verschillende benaderingen die niet celextractie en directe eiwit behandeling nodig hebben ontwikkeld. Een benadering is gebaseerd op de vaststelling van auxotrofe yeast stammen, verkregen door deletie van genen die coderen voor essentiële metabole enzymen. Dergelijke genen omvatten HIS3, LEU2, LYS2 en TRP1, coderen voor enzymen die nodig zijn voor aminozuur biosynthese en URA3 dat OMP decarboxylase codeert (Ura3), een enzym van pyrimidine biosynthese ribonucleotide. Ura3 is op grote schaal gebruikt in de eiwitafbraak studies. In deze testen constitutieve expressie van Ura3 redt groei van ura3 cellen in uracil-deficiënt medium 13. Derhalve gedestabiliseerd Ura3 door de fusie van een degron kan celgroei verspilling van minimaal medium zonder uracil. Deze werkwijze is gebruikt in diverse eiwitafbraak onderzoeken, inclusief de identificatie van determinanten degradatie 5, E3 ligasen 14 en hulpstoffen ubiquitinering factoren 15 en de ontdekking van nieuwe UPS degrons 16. Al deze methoden celgroei op agarplaten als assay uitlezing. Echter, tHij groei criterium (positieve / negatieve groei), terwijl robuust en efficiënt is meestal kwalitatieve en niet kwantitatieve informatie die belangrijk is voor het evalueren potentie een degron of de relatieve bijdrage van de verschillende hulpstoffen afbraak factoren verschaffen.
We hebben daarom en gebruikt gistvectoren en selectie mogelijk systematische en kwantitatieve analyse van eiwitafbraak door de URA3 -degron fusiesysteem. Het protocol is gebaseerd op een eenvoudig te hanteren assay die Groeikinetiek meet in vloeibare kweek onder selectieve omstandigheden (Gils) en het genereren van standaard groeicurves. Gist groei kinetiek worden gekenmerkt door drie fasen – de vertraging, de exponentiële (log) en de stationaire fase. Berekening van gist replicatie kinetiek gedurende de log-fase onder selectieve omstandigheden, die wordt bepaald door de niveaus van expressie van het Ura3-degron, geeft een onbevooroordeelde kwantitatieve meting of eiwitafbraak. Deze methode kan worden toegepast voor het meten en vergelijken van afbraaksnelheden van meerdere UPS substraten gelijktijdig meerdere stammen en onder verschillende omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een test op basis van de celgroei voor het bepalen van de relatieve eiwitafbraak prijzen, genoemd 'Groeikinetiek in Liquid cultuur onder Selectief omstandigheden' (Gils). De Gils assay heeft een aantal voordelen: Het is eenvoudig in te stellen, data-acquisitie en analyse is eenvoudig en het is uiterst modulair. Bijgevolg kan gils gelijktijdig uitgeoefend op meerdere monsters in een gebruiksvriendelijke multi-well plaat formaat dat kan worden aangepast aan automatisering voor high throughput t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma – Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma – Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma – Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma – Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96 well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma – Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used | |
| MDTcalc | Experimental software |
Riferimenti
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetica. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
