神经血管重塑的分析Entorhino，海马脑切片培养
Summary
一种协议，用于entorhino，海马脑片培养，允许再生缺血性脑损伤的多个方面，提出了。通过研究，除了在神经血管的变化，以改变神经元，该协议是一个多功能的工具损伤后，研究塑料改变神经组织。
Abstract
缺血性脑损伤中最常见的和毁灭性的条件影响正常的脑功能，常常导致持续的功能缺陷，在受影响的病人。尽管密集的研究努力，但仍可以减少神经元损伤，并保护在从延迟次级死亡的缺血区的神经元用没有有效的治疗选择。这方面的研究通常涉及使用复杂的和有问题的动物模型。挑战与氧和葡萄糖剥夺（OGD）Entorhino，海马脑片培养是建立在模仿脑缺血体外模型。本研究的新颖的方面是，对脑血管的变化进行了研究，除了神经元的变化和两者的神经隔腔和血管隔室中的反应可以进行比较和相关性。在这个协议中提出的方法，大大拓宽了潜在的应用程序或ganotypic切片培养方法。 OGD或单独缺氧诱导可以通过在器官切片培养物，而简单的装置来施加，并导致在神经组织可靠和可再现的损伤。与此形成鲜明对比的是复杂的和有问题的动物实验中诱发中风和缺血体内 。通过扩大分析，包括血管可以提供关于如何保护和恢复大脑功能的新途径反应的研究。这里介绍的切片培养方法可能发展成一个有吸引力的和重要的工具，缺血性脑损伤的研究，并可能是用于测试目的的神经保护潜力的治疗措施是有用的。
Introduction
中枢神经系统是特别敏感的损失或减少的氧和葡萄糖的供应通过脉管。血液供应到大脑，即使是很短的中断能引起领导的典型中风病证的相关脑区的功能永久性丧失。除了在主影响区域的神经元丧失，存在通常是通过二次伤害附加迟发性神经元损失。遗憾的是到现在为止，没有任何神经保护治疗继发性神经元死亡的减少是可用1。学习继发性损害的机制研究工作依赖于使用脑缺血就像大脑中动脉闭塞和各种血栓闭塞技术的动物模型（对于最近的综述见2）。同时，也由于限制和使用动物模型，各种中枢神经系统组织器官切片文化的伦理问题已使用，允许STUDY神经元的反应不同类型的伤害3-5的。
对于学习，模仿缺血性脑损伤的条件下神经元的反应，已经开发了氧糖剥夺模型系统（OGD）。在这个模型中，切片培养物暂时暴露在缺乏葡萄糖，并已达到平衡，用氮气在不存在氧的平台。通过这样的处理，因此能够诱导神经元损伤和损失，这是相当一个类似于体内 6,7缺血性损伤后观察到的，在海马，这种处理诱导的神经元损失特别是在CA1区，而不是在CA3区和海马齿状回。与此相反，在切片培养血管反应的研究至今还没有得到广泛开展。一个显而易见的原因是在切片养殖模式，缺乏循环和血管的灌注。然而，我们已经有可能保持b前面所示lood血管中枢片培养了好几天8,9。
这种方法的总体目标是，不仅可以监测神经元缺氧缺糖后的命运，但延长的研究，这是损伤反应的重要组成部分血管的命运和重塑。直至现在这样的研究需要使用动物实验（德容等人，1999;卡瓦利亚等人，2001）。在该协议在这里提出，我们将详细介绍如何这样的研究可以做到entorhino，海马脑片培养的挑战无论是与缺氧或兴奋毒性损伤后两个神经元的存活和血管反应的分析。该协议是基于先前发表的研究报告对这个问题10，并且可以为有意在中枢神经系统的神经血管的相互作用任何实验室用。
Protocol
Representative Results
Discussion
用这里介绍的方法，海马脑切片培养物可被用作一个通用的工具损伤后，研究塑料的改变的神经组织。虽然器官切片文化已被用于在过去的研究神经元的反应缺血后6，7的血管改变的同时进行研究的新局面显著增强了该方法的应用潜力。 OGD或单独缺氧诱导可以通过在器官切片培养物，而简单的装置来施加，并导致在神经组织可靠和可再现的损伤。此外，切片培养方法允许不仅研究缺?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了巴塞尔大学生物医学系，以及瑞士国家科学基金会（31003A_141007）的支持。马库斯Saxer提供了技术支持。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
Riferimenti
- Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
- Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
- Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
- Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
- Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
- Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
- Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscienze. 170, 361-371 (2010).
- De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscienze. 91, 203-210 (1999).
- Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
- Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
