Real Time Analyse af metaboliske profil i<em> Ex Vivo</em> Mus Intestinal Crypt organoide Cultures
Summary
Små intestinale krypt organoids dyrket ex vivo tilvejebringe en vævskultur, der sammenfatter vækst af krypter afhængige af stamceller og deres niche. Vi har etableret en metode til at analysere den metaboliske profil i realtid i primær mus krypt organoids. Vi fandt organoids opretholde fysiologiske egenskaber, der er defineret ved deres kilde.
Abstract
Tyndtarmens slimhinde udviser et repetitivt arkitektur organiseret i to grundlæggende strukturer: villi, som rager ind i det intestinale lumen og sammensat af modne enterocytter, bægerceller og enteroendocrine celler; og krypter, bosiddende proximalt til submucosa og muscularis, der huser voksne stamceller og progenitorceller og modne Paneth celler, samt stromale celler og immunceller i krypten mikromiljø. Indtil de sidste par år, blev in vitro studier af tyndtarmen begrænset til cellelinier afledt fra enten godartede eller ondartede svulster, og ikke repræsenterer fysiologi af normale tarm epitel og indflydelse mikromiljø, hvor de bor. Her viser vi en fremgangsmåde tilpasset fra Sato et al. (2009) til dyrkning af primære muse intestinale krypt organoids afledt fra C57BL / 6-mus. Derudover præsenterer vi brugen af krypt organoide kulturer at analysere krypten metaboliske profil i realtid ved foranstaltningenling af basal iltforbrug, glycolytisk sats, ATP-produktion og respiratorisk kapacitet. Organoids vedligeholde ejendomme defineret ved deres kilde og fastholde aspekter af deres metaboliske tilpasning afspejles af ilt forbrug og ekstracellulære forsuring satser. Realtid metaboliske studier i denne krypt organoide kultur-system er et kraftfuldt værktøj til at studere krypt organoide stofskifte energi, og hvordan den kan moduleres ved ernæringsmæssige og farmakologiske faktorer.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) er den tredje hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i USA. Sporadisk tyktarmskræft – nemlig at der opstår senere i livet (> 50 år), og uden klare disponerende genetiske faktorer – tegner sig for ca. 80% af alle tilfælde, med forekomsten stærkt påvirket af langsigtede kostvaner 1,2. Disse tumorer udviser en metabolisk skift i retning af afhængighed af oxidativ glycolysen, kendt som Warburg virkning, hvilket delvist kan gøre højere koncentrationer af cellulære byggesten og energi til rådighed (gennem glutaminolysis) for at tillade og måske køre høje tumorcelleproliferation 3-5 . Undersøgelser af tyktarmskræft samt andre gastrointestinale cancerformer, herunder tyndtarmen kræft giver vigtig indsigt i årsagen til tumor formation. Undersøge metaboliske forskelle mellem normale, pro-tumorigene og tumorigene tilstande af gastrointestinale organsystemer kan bistå itermination af relativ risiko for tumor udvikling samt tidlig påvisning af neoplasi. Desuden vil forstå bioenergetic metabolisme involverer mitokondrie respiration og glykolyse give grundlæggende indsigt i, hvordan celle fysiologi, aldring og sygdom tilstand forstyrrer tarm homøostase. Udnyttelse af bioenergetik assay teknologi til ekstracellulær flux analyse kan vurdere satserne for mitokondrie respiration og glykolyse samtidigt i celler, der vokser i kultur i realtid 6,7.
Indtil for nylig var in vitro studier af tyndtarmen begrænset til cellelinier afledt fra enten godartede eller ondartede svulster 8,9 og ikke repræsenterer fysiologi af normale tarm epitel og indflydelse mikromiljø, hvor de bor. I 2009 Sato et al. 10 indført en ex vivo kultur system til at vokse tre-dimensionelle (3D) mus tarmepitelceller organoids eller epithelial "mini-indvolde", der er egnede til forsøg, diagnostiske og terapeutiske undersøgelser 10,11. Desuden krypter isoleret fra calorically begrænset mus opretholde deres ændrede vækstegenskaber som organoids i sådanne kulturer 12. Sammenlignet med transformerede cellelinier kan krypt organoide kulturer anvendes til at frembringe fysiologisk relevante data, der udgør en langt bedre model for at forstå in vivo tilstand.
Vi har tilpasset bioenergetik analyse teknologi til analyse energiomsætning af intestinale krypt organoids. Mus tarm krypt organoids blev dyrket ex vivo til at udvikle de krypt organoide energi metabolismeundersøgelser præsenteret. Oxygenforbrugshastigheden (OCR) og den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) af krypt organoids blev målt i fravær og nærvær af to forskellige metaboliske inhibitorer (oligomycin, rotenon) og en ion bærer (carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Krypten organoid metaboliske reaktion på disse kemiske forbindelser lykkedes afspejlet gennem skiftende ECAR og OCR-værdier.
Cellular bioenergetic studier vil belyse de gensidige interaktioner mellem metabolisk tilstand og risiko for sygdom og fænotype i kræft, fedme, diabetes, stofskiftesygdomme og mitokondriesygdomme og hjælpe forskud screeningsmetoder med direkte følger for translationel medicin. Her beskriver vi en detaljeret protokol til at isolere tyndtarmens krypter og kultur krypt organoids. Derudover introducerer vi en ny metode til at bruge krypt organoide kulturer for metaboliske assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi testede oxygenforbrugshastigheden (OCR) og den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) af krypter isoleret fra 8-måneder gamle mus og dyrkes i organoids ex vivo. Efter måling af basal rate blev crypt metabolisme evalueret ved tilsætning oligomycin, carbonyl cyanid -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og rotenon sekventielt.
Basal OCR og basal ECAR blev registreret 0-29 min (figur 2A og 2B). På 29. min blev oligomycin (fra …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 og P3013330 fra National Institutes of Health.
Vi vil gerne takke Michele Houston, Elena Dhima og Dr. Anna Velcich for deres værdifulde kommentarer i udviklingen krypten isolation protokollen.
Vi takker også Diabetes Uddannelse og Research Center for Albert Einstein College of Medicine støttet af NIH P60DK20541, og Dr. Michael Brownlee og Dr. Xue-Liang Du, der leder og driver Seahorse facilitet hhv.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
Riferimenti
- Jemal, A., et al. . CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
