Real Time Analisi di profilo metabolico in<em> Ex Vivo</em> Culture del mouse intestinale Cripta organoide
Summary
Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte.
Abstract
La mucosa dell'intestino tenue presenta un'architettura ripetitiva organizzata in due strutture fondamentali: villi, sporgenti nel lume intestinale e composti da enterociti maturi, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine; e cripte, che risiedono in prossimità del sottomucosa e muscolare, l'ospitare staminali adulte e cellule progenitrici e cellule mature Paneth, così come stromali e cellule del sistema immunitario del microambiente cripta. Fino agli ultimi anni, studi in vitro di piccolo intestino era limitato a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni, e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l'influenza del microambiente in cui risiedono. Qui, dimostriamo un metodo adattato da Sato et al. (2009) per la coltura di organoidi cripta del mouse intestinali primarie derivate da topi C57BL / 6. Inoltre, vi presentiamo l'uso di colture organoide cripta di saggiare il profilo metabolico cripta in tempo reale per misurazione del consumo basale di ossigeno, glicolisi, la produzione di ATP e la capacità respiratoria. Organoidi mantengono proprietà definite per la loro origine e conservano gli aspetti del loro adattamento metabolico riflessa dal consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare. In tempo reale studi metabolici in questo organoide sistema di coltura cripta sono un potente strumento per studiare il metabolismo energetico organoide cripta, e come possono essere modulati da fattori nutrizionali e farmacologici.
Introduction
Cancro del colon-retto (CRC) è la terza causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti. Cancro del colon sporadica – vale a dire che derivanti nel corso della vita (> 50 anni di età) e senza fattori predisponenti genetici chiare – conti per ~ 80% di tutti i casi, con un'incidenza fortemente influenzata da abitudini alimentari a lungo termine 1,2. Questi tumori presentano uno spostamento metabolico verso dipendenza glicolisi ossidativa, noto come effetto Warburg, che può in parte rendere concentrazioni elevate di particelle elementari cellulari e di energia disponibili (attraverso glutaminolysis) permettere e forse guidare alti tassi di proliferazione delle cellule tumorali 3-5 . Studi di tumore del colon e altri tumori gastrointestinali, inclusi piccoli tumori intestinali fornire informazioni importanti sulle cause della formazione di tumori. Indagare le differenze metaboliche tra gli stati normali, pro-tumorali e tumorali di sistemi di organi gastrointestinali possono aiutare detine di rischio relativo per lo sviluppo del tumore e la diagnosi precoce della neoplasia. Inoltre, la comprensione del metabolismo bioenergetico che coinvolge la respirazione mitocondriale e la glicolisi si forniscono informazioni fondamentali sul modo in cui la fisiologia delle cellule, l'invecchiamento e la malattia lo stato perturba l'omeostasi intestinale. L'utilizzo della tecnologia bioenergetica test per l'analisi del flusso extracellulare in grado di valutare i tassi di respirazione mitocondriale e glicolisi contemporaneamente in cellule in crescita in coltura in tempo reale 6,7.
Fino a poco tempo, studi in vitro di tenue sono stati limitati a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni 8,9 e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l'influenza del microambiente in cui risiedono. Nel 2009, Sato et al. 10 ha introdotto un sistema ex vivo della cultura a crescere tridimensionale (3D) del mouse intestinali organoidi epiteliali, o epithelial "mini-coraggio", adatto a fini sperimentali, diagnostiche e terapeutiche indagini 10,11. Inoltre, cripte isolate da topi calorico limitati mantengono le loro proprietà di crescita alterati come organoidi in tali colture 12. Rispetto a linee cellulari trasformate, culture organoide cripta possono essere utilizzati per generare dati fisiologicamente rilevanti che presentano un modello molto meglio comprendere lo stato in vivo.
Abbiamo adattato la tecnologia di analisi bioenergetica per saggiare il metabolismo energetico di organoidi cripta intestinale. Mouse organoidi cripta intestinale sono state coltivate ex vivo per lo sviluppo degli studi cripta metabolismo energetico organoide presentati. Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di organoidi cripta sono stati misurati in assenza e in presenza di due diversi inibitori metabolici (oligomicina, rotenone) e un vettore di ioni (Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone). L'orga criptarisposta metabolica noid a questi composti chimici sono riflessi con successo attraverso la modifica ECAR e valori OCR.
Studi bioenergetici cellulari potranno chiarire le reciproche interazioni tra stato metabolico e rischio di malattia e fenotipo nel cancro, obesità, diabete, malattie metaboliche e le malattie mitocondriali e contribuire a metodi di screening anticipo aventi implicazioni dirette per la medicina traslazionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare piccole cripte intestinali e alla cultura organoidi cripta. Inoltre, si introduce un nuovo metodo per usare le culture organoide cripta per le analisi metaboliche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo testato il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cripte isolate da 8 mesi topi e cresciuti in organoidi ex vivo. Dopo la misurazione del tasso basale, il metabolismo cripta è stata valutata con l'aggiunta di oligomicina, il cianuro di carbonile -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e rotenone, in sequenza.
Basale OCR e ECAR basale sono stati registrati 0-29 min (Figura 2A e 2B). …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 dal National Institutes of Health.
Vorremmo ringraziare Michele Houston, Elena Dhima e Dott.ssa Anna Velcich per i loro preziosi commenti nello sviluppo del protocollo di isolamento cripta.
Ringraziamo anche la formazione del diabete e Centro di Ricerca del Albert Einstein College of Medicine sostenuto da NIH P60DK20541, e il dottor Michael Brownlee e il dottor Xue Liang-Du, che dirigono e operano la struttura Seahorse, rispettivamente.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
Riferimenti
- Jemal, A., et al. . CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
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- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
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- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
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