Real Time Analyse av metabolsk profil i<em> Ex Vivo</em> Mouse Tarm Crypt Organoid Cultures
Summary
Tynntarms krypten organoids dyrket ex vivo gi en vev kultur system som rekapitulerer vekst av krypter avhengig av stamceller og deres nisje. Vi etablerte en metode for å analysere den metabolske profil i sanntid i primær muse krypten organoids. Vi fant organoids opprettholde fysiologiske egenskaper som er definert av deres kilde.
Abstract
Den lille tarmslimhinnen viser en repeterende arkitektur organisert i to grunnleggende strukturer: villi, som stikker ut i tarmlumen og består av modne enterocytter, slimceller og enteroendocrine celler; krypter, og som befinner seg proksimalt til submukosa og muscularis, husing voksen stilk og progenitorceller og modne Paneth-celler, så vel som stromal og immunceller av krypten mikromiljøet. Inntil de siste årene, ble in vitro studier av tynntarmen begrenset til cellelinjer som stammer fra enten godartede eller ondartede svulster, og ikke representerer fysiologi av normale tarm epitel og påvirkning av mikromiljøet der de bor. Her viser vi en metode tilpasset fra Sato et al. (2009) for dyrking primære musetarm krypten organoids avledet fra C57BL / 6 mus. I tillegg presenterer vi bruk av krypten organoid kulturer å analysere krypten metabolsk profil i sanntid etter målling av basal oksygenforbruk, glycolytic rate, ATP produksjon og luftkapasitet. Organoids opprettholde egenskapene definert av deres kilde og beholde aspekter av deres metabolske tilpasning reflekteres av oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser. Sanntid metabolske studier på dette krypten organoid kultursystem er et kraftig verktøy for å studere krypten organoid energistoffskiftet, og hvordan det kan bli modulert av ernæringsmessige og farmakologiske faktorer.
Introduction
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA. Sporadisk tykktarmskreft – det vil si at som oppstår senere i livet (> 50 år), og med ingen klare predisponerende genetiske faktorer – står for ~ 80% av alle tilfeller med forekomsten sterkt påvirket av langsiktige kostholdet 1,2. Disse svulstene utviser en metabolsk dreining mot avhengighet av oksidativt glykolyse, kjent som Warburg effekten, som kan delvis være høyere konsentrasjoner av cellulære byggesteiner og energi tilgjengelig (gjennom glutaminolysis) for å tillate og kanskje kjøre høy forekomst av tumorcelleproliferasjon 3-5 . Studier av kreft i tykktarmen, så vel som andre gastrointestinale cancere, inkludert tynntarmen kreftformer gir viktig innsikt inn i årsaken til tumordannelse. Gransker metabolske forskjeller mellom normale, pro-tumorigene og tumorigene tilstander av gastrointestinale organsystemer kan hjelpe Fondetermination av relativ risiko for svulst utvikling samt tidlig deteksjon av neoplasi. Videre vil forstå bioenergetisk metabolisme involverer mitokondrie respirasjon og glykolyse gi grunnleggende innsikt i hvordan cellefysiologi, aldring og sykdomstilstand perturbs intestinal homeostase. Utnyttelse av bioenergi analyseteknologi for ekstracellulære flux analyse kan vurdere satsene mitokondriell respirasjon og glykolyse samtidig i celler som vokser i kultur i sanntid 6,7.
Inntil nylig, ble in vitro-studier av tynntarmen begrenset til cellelinjer avledet fra enten benigne eller maligne tumorer 8,9 og ikke representere fysiologien av normale intestinale epitel og påvirkning av mikromiljøet i hvilket de befinner seg. I 2009, Sato et al. 10 innført en ex vivo kultursystem til å vokse tre-dimensjonale (3D) mus intestinal epithelial organoids, eller epithelial "mini-guts", egnet for eksperimentelle, diagnostiske og terapeutiske undersøkelser 10,11. Videre krypter isolert fra calorically begrenset mus opprettholde sine endrede vekstegenskaper som organoids i slike kulturer 12. Sammenlignet med transformerte cellelinjer, kan krypten organoid kulturer anvendes til å generere fysiologisk relevante data som representerer en langt bedre modell for å forstå den in vivo tilstanden.
Vi tilpasset bioenergi analyse teknologi for å analysere energimetabolismen av intestinal krypten organoids. Mus intestinal krypten organoids ble dyrket ex vivo for å utvikle crypt organoid energiomsetningen studier presentert. Den oksygenforbruksrate (OCR) og det ekstracellulære surgjøring hastighet (ecar) av krypten organoids ble målt i fravær og nærvær av to forskjellige metabolske inhibitorer oligomycin (rotenon) og en ione-bærer (karbonyl-cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Krypten organisanoid metabolsk respons til disse kjemiske forbindelsene ble vellykket reflektert gjennom skiftende ecar og OCR verdier.
Cellular bioenergetisk studier vil belyse de gjensidige interaksjoner mellom metabolske tilstand og sykdomsrisiko og fenotype i kreft, fedme, diabetes, stoffskifteforstyrrelser og mitokondrielle sykdommer og hjelpe forhånd screening metoder med direkte implikasjoner for translasjonell medisin. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere tynntarms krypter og kultur krypten organoids. Dessuten introduserer vi en ny metode å bruke krypten organoid kulturer for metabolske analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi testet oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ecar) av krypter isolert fra 8-måneder gamle mus og vokst til organoids ex vivo. Etter måling av basaldosen, ble krypten metabolisme evaluert ved å legge oligomycin, -karbonyl cyanid -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og rotenon, sekvensielt.
Basal OCR og basal ecar ble registrert 0-29 min (Figur 2A og 2B). På den 29. minutter ble oligomycin (fra port A) in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet med tilskudd RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 og P3013330 fra National Institutes of Health.
Vi vil gjerne takke Michele Houston, Elena Dhima og Dr. Anna Velcich for deres verdifulle kommentarer i utviklings krypten isolasjon protokollen.
Vi takker også Diabetes Training og Research Center av Albert Einstein College of Medicine støttes av NIH P60DK20541, og Dr. Michael Brownlee og Dr. Xue-Liang Du, som styrer og driver Seahorse anlegget, henholdsvis.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
Riferimenti
- Jemal, A., et al. . CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
