В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em> Экс Vivo</em> Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры
Summary
Малые кишечные склеп органоиды культивировали экс естественных обеспечить систему культуры тканей, что повторяет рост склепов, зависящих от стволовых клеток и их нишу. Мы создали метод для анализа метаболического профиля в режиме реального времени в первичной мыши крипт органоидов. Мы нашли органоиды сохранить физиологические свойства, определяемые их источника.
Abstract
Слизистой оболочки тонкой кишки показывает повторное архитектуру организованы в две основных структур: ворсинок, выступающими в просвет кишечника и состоящих из зрелых энтероцитов, бокаловидных клеток и клеток энтероэндокринные; и склепы, проживающих проксимальнее подслизистой и мышечной, укрывательства стволовых взрослых и клеток-предшественников и зрелые клетки Панета, а также стромальных и иммунные клетки крипт микросреды. До последних нескольких лет, в пробирке исследования тонкой кишки не был ограничен клеточных линий, полученных из или доброкачественных или злокачественных опухолей, и не представляют физиологию эпителии нормальной кишечной и влияние микросреды, в которой они находятся. Здесь мы демонстрируем метод адаптированный Сато и др. (2009) для культивирования первичных мыши кишечных крипт органоиды, полученные из C57BL / 6. Кроме того, мы представляем использование крипт Органоид культур для анализа склепа метаболический профиль в режиме реального времени по мерение базального потребления кислорода, гликолитического скоростью, продукции АТФ и дыхательной емкости. Органоидов сохранить свойства, определяемые их источника и сохранить аспекты их метаболической адаптации отраженного потребления кислорода и внеклеточного ставок подкисления. В режиме реального времени метаболические исследования в этой крипте Органоид системы культуры являются мощным инструментом для изучения склепа Органоид энергетический обмен, и как это можно модулировать питания и фармакологических факторов.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) является третьей ведущей причиной рака, связанных с смертей в Соединенных Штатах. Широкоэкранный рак толстой кишки – то есть, что возникающие в дальнейшей жизни (> 50 лет) и без каких-либо четких предрасполагающих генетических факторов – приходится ~ 80% всех случаев, с частотой сильным влиянием долгосрочных рациона питания 1,2. Эти опухоли обнаруживают метаболический сдвиг в сторону зависимости от окислительного гликолиза, известный как эффект Варбурга, который может частично принимать более высокие концентрации клеточных строительных блоков и энергии, доступных (через glutaminolysis), чтобы разрешить и, возможно, ездить высокие темпы пролиферации опухолевых клеток 3-5 , Исследования рака толстой кишки, а также другие желудочно-кишечные раковые включая маленьких раков кишечника обеспечивают важное понимание причины образования опухоли. Исследуя метаболические различия между нормальными, про-онкогенных и онкогенных состояний желудочно-кишечного тракта системы органов могут помочь DETermination относительного риска развития опухолей, а также раннего выявления новообразований. Более того, понимая, биоэнергетический метаболизм с участием дыхание митохондрий и гликолиза обеспечит фундаментальную понимание того, как клетки физиологии, старение и болезнь государство возмущает кишечный гомеостаз. Использование технологии биоэнергетика анализа для внеклеточной анализа потока может оценить темпы митохондриального дыхания и гликолиза одновременно в клетках, растущих в культуре в реальном времени 6,7.
До недавнего времени исследования в пробирке из тонкой кишки не были ограничены клеточных линиях, полученных из или доброкачественных или злокачественных опухолей 8,9 и не представляют физиологию нормальной кишечной эпителия и влияние микросреды, в которой они проживают. В 2009 году Сато и др. 10 введен экс естественных культуры систему, чтобы расти трехмерная (3D) мыши кишечные эпителиальные органоиды, или epithelial "мини-кишки", пригодных для экспериментальных, диагностических и терапевтических исследований 10,11. Кроме того, склепы, выделенные из калорийно ограниченных мышей сохранить свои измененные свойства роста как органоидов в таких культурах 12. По сравнению с трансформированных клеточных линий, крипт Органоид культуры могут быть использованы для создания физиологически соответствующие данные, представляющие гораздо лучше понять модель в естественных условиях состояние.
Мы адаптировали технологию анализа биоэнергетический для анализа энергетического метаболизма кишечной крипт органоидов. Mouse кишечного склеп органоиды культивировали экс естественных развивать склепе Органоид исследования энергетического метаболизма представленные. Расход кислорода (OCR) и внеклеточный скорость подкисление (РВЦА) из крипт органоидами были измерены в отсутствие и в присутствии двух различных метаболических ингибиторов (олигомицин, Ротенон) и ионным носителем (карбонил цианид-п-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Склеп оргасоленоида метаболическая реакция на эти химические соединения были успешно отражены за счет изменения РВЦА и ценностей OCR.
Сотовые биоэнергетические исследования будет выяснить взаимные взаимодействия между метаболического состояния и риска болезни и фенотипа в рак, ожирение, сахарный диабет, нарушения обмена веществ и митохондриальных заболеваний и способствовать продвижению методов скрининга с прямыми последствиями для поступательного медицины. Здесь мы опишем Подробный протокол изолировать небольшие кишечных крипт и культуры крипт органоидов. Кроме того, мы вводим новый способ использовать крипт Органоид культур для метаболических анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы протестировали уровень потребления кислорода (OCR) и внеклеточный скорость подкисления (РВЦА) крипт, выделенных из 8-месячных мышей и выращенных в органоиды экс естественных. После измерения базальной скорости, склеп метаболизм оценивалась путем добавления Олигомицин, карбонил?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами РВЫХ1 ЦА 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 и P3013330 от Национальных Институтов Здоровья.
Мы хотели бы поблагодарить Микеле Хьюстон, Елена Dhima и д-р Анна Velcich за ценные замечания при разработке протокола изоляции склеп.
Мы также благодарим диабета учебно-исследовательский центр в колледже Альберта Эйнштейна медицины при поддержке NIH P60DK20541, и д-р Майкл Браунли и доктор Сюэ-Лян Ду, которые прямого и управлять Seahorse центр, соответственно.
Materials
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1X) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) – step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml | Life Technologies | 15240-062 | Final Concentration 1 X or 2 X |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final Concentration 1 X |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final Concentration 10 mM |
| N-Acetyl-L-Cysteine, 25g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final Concentration 1 mM |
| 100X N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final Concentration 1 X |
| 50X B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final Concentration 1 X |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final Concentration 500 ng / mL |
| Recombinant Murine EGF, 100ug | Peprotech | 315-09 | Final Concentration 50 ng / mL |
| Recombinant Murine Noggin, 20ug | Peprotech | 250-38 | Final Concentration 100 ng / mL |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final Concentration 2 mM |
| Gibco® Glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final Concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| DTT (Dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final Concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1 % in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1 % in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final Concentration 10 µM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final Concentration 1 µM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final Concentration 1 µM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final Concentration 1 µM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final Concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
Riferimenti
- Jemal, A., et al. . CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
