Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l'analyse "Cargo Mapping"
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Comprendre les mécanismes par lesquels les moteurs moléculaires coordonnent leurs activités pour le transport de cargaisons vésiculaires dans les neurones nécessite l'analyse quantitative des associations moteur / de fret au niveau de la vésicule unique. Le but de ce protocole est d'utiliser la microscopie quantitative de fluorescence à corréler («carte»), la position et la directionnalité du mouvement de fret direct aux montants de composition et relatives des moteurs associés avec la même cargaison. "Cartographie Cargo» se compose de l'imagerie en direct de cargaisons marquées par fluorescence mobiles dans les axones cultivées sur des dispositifs microfluidiques, suivie par la fixation chimique lors de l'enregistrement de mouvement direct, et immunofluorescence ultérieure (IF) des mêmes régions axonales exactes avec des anticorps contre les moteurs. Colocalisation entre cargaisons et leurs moteurs est évaluée en affectant la position sous-pixel de coordonnées de canaux de moteur et de fret, par gaussiennes de montage à la diffraction-lifonctions d'étalement de point mited représentant sources ponctuelles fluorescentes individuelles. Images de fret et moteur fixe sont ensuite superposées à des parcelles de mouvement de la cargaison, à la «carte» à leurs trajectoires suivies. La force de ce protocole est la combinaison de vivre et si les données à enregistrer à la fois le transport de cargaisons vésiculaires dans des cellules vivantes et de déterminer les moteurs associés à ces mêmes vésicules exactes. Cette technique permet de surmonter les problèmes antérieurs qui utilisent des méthodes biochimiques pour déterminer la composition moyenne du moteur de populations purifiées de vésicules en vrac hétérogènes, car ces méthodes ne révèlent pas des compositions sur des cargaisons de mobiles simples. Par ailleurs, ce protocole peut être adapté à l'analyse d'autres voies de transport et / ou de traite dans d'autres types de cellules à mettre en corrélation le mouvement des structures intracellulaires individuels avec leur composition en protéines. Limitations de ce protocole sont le débit relativement faible en raison des faibles efficacités de transfection de cultureneurones primaires et un champ de vision limité disponible pour l'imagerie haute résolution. Les applications futures pourraient inclure des méthodes pour augmenter le nombre de neurones exprimant cargaisons marquées par fluorescence.
Introduction
Le transport intracellulaire est essentiel dans tous les types de cellules pour la délivrance de protéines, les membranes, les organelles et les molécules de signalisation cellulaire à divers domaines 1. Les neurones sont des cellules spécialisées avec très longues, projections polarisés qui dépendent de façon critique sur le transport intracellulaire des cargaisons essentielles pour leur livraison sur de longues distances à différents microdomaines axonales. Ce transport est médiée par kinésines et dynéines – deux grandes familles de protéines motrices moléculaires – qui se lient à des cargaisons et de suivre le long des microtubules polarisés en antérograde et rétrograde directions, respectivement. Alors que le mouvement rétrograde est principalement médiée par la dynéine, le mouvement dans le sens antérograde est facilitée par une grande famille, la diversité fonctionnelle de moteurs de kinésine. Par conséquent, le transport antérograde des cargaisons axonales pourrait être médiée par divers membres de la famille de la superfamille kinésine 1-5. Bien que certaines cargaisons se déplacent constamment dans les deux sens, ma plupart des cargaisons se déplacent de manière bidirectionnelle et inversent souvent sur leur chemin vers leurs destinations finales 1,5-13. En outre, il a été démontré que les moteurs d'opposition à directivité associé simultanément à cargaisons, ce qui soulève la question de savoir comment le mouvement réglementé de cargaisons est coordonné par des moteurs de polarité opposée 5-7. Ensemble, le transport de cargaisons axonales est un processus concerté qui est réglementée par la composition de moteurs et de leurs activités biochimiques spécifiques, qui sont à leur tour dépendent de divers adaptateurs et partenaires de liaison de réglementation 14.
Pour décrire fidèlement le mécanisme de transport axonal pour une marchandise spécifique et à découvrir la réglementation sous-jacente de ce transport, il est primordial de déterminer la composition des protéines de moteur et de leurs partenaires de liaison réglementaires inhérents aux cargaisons individuelles lors de leur transport direct. D'autres méthodes, par exemple des approches biochimiques, fournissent des estimations de mot moyenneou compositions sur les populations de vésicules hétérogènes purifiés, mais ces estimations ne révèlent pas le type ou la quantité de moteurs associés à des vésicules mobiles simples. En outre, la reconstitution de transport le long des microtubules vésicule préassemblés in vitro a permis de mesurer la quantité d'un type de moteur à un niveau de 15 vésicule unique. Toutefois, ces expériences ne sont pas corrélés directement la quantité de moteurs avec des caractéristiques de transport de ces vésicules, et le transport mesurées en l'absence de facteurs de régulation cellulaire.
Un protocole est présentée ici, qui détermine la composition de moteur (type et la quantité relative des moteurs) de vésicules mobiles individuels à partir d'immunofluorescence (IF) des données de mesure de manière endogène exprimé protéines motrices, et en corrélation de ces paramètres pour le transport direct des mêmes vésicules exactes dans les neurones 16. Cette méthode implique une cartographie précise des données SI-à-vivre mouvement de la cargaison. Ceci est accompli en growing neurones de l'hippocampe de souris dans des dispositifs microfluidiques qui suit les protocoles établis, 17-19. Ces dispositifs permettent l'identification et la corrélation ("mapping") des axones et des cargaisons mobiles simples dans les modalités fixes et vivantes microscopie de lumière (Figure 1). Des neurones en culture sont transfectées avec des protéines par fluorescence de fret marqués dont le transport est imagée à une résolution spatiale et temporelle pour obtenir des informations détaillées mouvement qui est tracée dans kymographs. Au cours de l'imagerie, les neurones sont fixées avec du paraformaldéhyde, et ensuite colorées avec des anticorps dirigés contre des protéines endogènes à moteur. Images de fret et moteurs fixes sont superposées sur kymographs de déplacement en live à la «carte» (colocalisent) les à la cargaison vivante mouvement trajectoires 16. Pour corréler le mouvement des cargaisons en direct avec l'association de protéines motrices, colocalisation est analysée en utilisant un logiciel MATLAB sur mesure appelé «MoTor colocalisation "16,20. Cargaisons et les moteurs marqués par fluorescence génèrent caractéristiques ponctuées limitée par la diffraction qui peuvent se chevaucher partiellement. Pour résoudre la position de chevauchement points lacrymaux, le logiciel adapte automatiquement la première gaussiennes pour chaque fonction d'étalement de point, représentant puncta fluorescent individu, afin de déterminer leur position précise sous-pixel de coordonnées XY et l'intensité des amplitudes de 21-23. Les positions des moteurs et des cargaisons par la suite par rapport à l'autre afin de déterminer la colocalisation 16,20. Par conséquent, cette méthode attribue plus précisément entre les points lacrymaux colocalisation fluorescente par rapport à d'autres méthodes 24.
La force de cette méthode est la capacité d'évaluer la colocalisation des moteurs à cargaison individuelle dans des cellules fixées, pour qui les trajectoires de mouvement vivants (par exemple, la direction dans laquelle ils se déplaçaient au moment de la fixation) ont été recorded. Avec cette méthode, les kinésines et dynéines ont été trouvés à la fois pour associer les vésicules qui transportent la protéine prion normale (PrPc -cellular), une cargaison enrichi neuronale qui se déplace de façon bidirectionnelle ou reste stationnaire dans les axones 16. Cette analyse a permis l'élaboration d'un modèle de travail pour la réglementation de la PrP C mouvement des vésicules dans lequel antérograde (kinésine) et (dynéine) moteurs rétrogrades coordonnent leurs activités afin de passer les vésicules dans les deux sens ou rester stationnaire pendant associée à la cargaison . Un autre point fort de cette méthode est son large potentiel d'application pour la caractérisation de colocalisation / association de nombreuses marchandises marquées par fluorescence qui se déplacent dans pratiquement n'importe quel type de cellule, avec toute autre protéine (s) d'intérêt. Ainsi, la corrélation en temps réel / fixe pourrait potentiellement permettre la détection d'interactions protéine-cargo transitoires, comme beaucoup individu marqué par fluorescence des particules en mouvement peut être analysé sur une p désiréeériode de temps. Compte tenu de la large applicabilité et le type de questions que cette méthode peut résoudre, ce protocole sera d'intérêt pour un large public de biologistes cellulaires, y compris ceux qui étudient le trafic et le transport dans les neurones ou dans d'autres types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici permet la corrélation de la directionnalité du mouvement des particules fluorescentes individuelles en mouvement sur la base de cargaison microtubules avec le type et la quantité de protéines motrices associées par rapport à des neurones vivants. Auparavant, la composition totale du moteur de cargaisons vésiculaires axonales a été dosée sur des populations hétérogènes de vésicules et des organites 9,15 biochimiquement purifiée. Cependant, la c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Riferimenti
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
