Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise "Mapeamento Cargo"
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Compreender os mecanismos pelos quais motores moleculares coordenam suas atividades para o transporte de cargas vesiculares dentro dos neurônios requer a análise quantitativa de associações motor / carga ao nível da vesícula única. O objetivo deste protocolo é a utilização de microscopia de fluorescência quantitativa correlacionar ("mapa") a posição e direcionalidade do movimento de cargas vivas à composição e relativas quantidades de motores associados com a mesma carga. "Mapeamento Cargo" consiste em imagens ao vivo de cargas marcados com fluorescência que se deslocam em axônios cultivadas em dispositivos microfluídicos, seguido de fixação química durante a gravação de movimento ao vivo, e posterior imunofluorescência (IF) coloração das mesmas regiões axonal exatas com anticorpos contra motores. Co-localização entre cargas e seus motores é avaliada através da atribuição de posição sub-pixel coordena a canais de motor e de carga, por funções de Gauss de montagem para a difração-liMITED funções ponto de propagação representam fontes pontuais fluorescentes individuais. De carga e motor imagens fixas são posteriormente sobreposta a parcelas de movimentação de cargas, para "mapear" os a suas trajetórias de rastos. A força deste protocolo é a combinação de viver e se os dados para gravar tanto o transporte de cargas vesicular em células vivas e para determinar os motores associados a essas mesmas vesículas exatas. Esta técnica ultrapassa os desafios anteriores que utilizam métodos bioquímicos para determinar a composição média do motor de populações heterogéneas de vesículas granel purificados, uma vez que estes métodos não revelam composições em cargas móveis individuais. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise de outras vias de transporte e / ou de tráfico em outros tipos de células para correlacionar o movimento das estruturas intracelulares individuais com a sua composição proteica. As limitações deste protocolo são a relativamente baixa taxa de transferência devido à baixa eficiência de transfecção de culturaneurônios primários e um campo de visão limitado disponível para imagens de alta resolução. As aplicações futuras poderão incluir métodos para aumentar o número de neurónios que expressam cargas marcados com fluorescência.
Introduction
Transporte intracelular é crucial em todos os tipos de células para a administração de proteínas, membranas, organelos, e moléculas de sinalização celulares a vários domínios 1. Os neurônios são células altamente especializadas, com, projeções polarizadas longos que criticamente dependem do transporte intracelular de cargas essenciais para a sua entrega de longa distância para várias microdomínios axonal. Este transporte é mediado por kinesins e dyneins – duas grandes famílias de proteínas motoras moleculares – que se ligam às cargas e acompanhar ao longo dos microtúbulos polarizados em anterógrada e retrógrada direções, respectivamente. Enquanto movimento retrógrado é mediada principalmente por dineína, o movimento na direcção anterógrada é facilitada por uma grande família, funcionalmente diversificada de motores de cinesina. Consequentemente, o transporte de cargas axonal anterógrado poderia ser mediada por vários membros da família do kinesin superfamília 1-5. Apesar de algumas cargas mover persistentemente em qualquer direção, mcargas ost mover bidirecionalmente e reverter freqüentemente em seu caminho para seus destinos finais 1,5-13. Além disso, demonstrou-se que os motores de direccionalidade associado opostas simultaneamente às cargas, levantando a questão sobre a forma como o movimento regulado de cargas é coordenado por motores de polaridade oposta 5-7. Juntos, o transporte de cargas axonais é um processo concertada que é regulada pela composição dos motores e das suas actividades bioquímicas específicas, que por sua vez são dependentes de vários adaptadores e parceiros de ligação de regulação 14.
Para descrever fielmente o mecanismo de transporte axonal para uma carga específica e para descobrir a regulação subjacente de que o transporte, é fundamental para determinar a composição de proteínas a motor e seus parceiros de ligação regulamentares associadas com cargas individuais durante o seu transporte de animais vivos. Outros métodos, como por exemplo abordagens bioquímicas, fornecer estimativas de mot médiaou composições sobre as populações heterogêneas vesícula purificados, mas estas estimativas não revelam o tipo ou a quantidade de motores associados ao único vesículas móveis. Além disso, a reconstituição do transporte de vesículas ao longo dos microtúbulos pré-montados in vitro permitiu a medição da quantidade de um tipo de motor em um único nível de vesícula 15. No entanto, estas experiências não se correlacionam directamente a quantidade de motores eléctricos com as características de transporte dessas vesículas, e medido o transporte, na ausência de factores de regulação celular.
Um protocolo aqui é apresentado, o qual determina a composição do motor (tipo e quantidade relativa de motores), da vesículas que se deslocam individuais a partir de imunofluorescência (IF) de dados de medição endogenamente expressa proteínas do motor, e correlaciona-se esses parâmetros para o transporte directo de exactas as mesmas vesículas em neurónios 16. Este método implica mapeamento preciso dos dados IF-to-live movimentação de cargas. Isto é conseguido por growing neurónios do hipocampo de rato em dispositivos de microfluidos de acordo com protocolos estabelecidos 17-19. Estes dispositivos permitem a identificação e correlação ("mapeamento") dos axônios e cargas móveis individuais nas modalidades de microscopia de luz fixa e ao vivo (Figura 1). Neurônios cultivados são transfectadas com proteínas de carga fluorescente etiquetado cujo transporte é fotografada em alta resolução espacial e temporal para obter informações detalhadas movimento que é representada em kymographs. Durante o curso de imagiologia, os neurónios foram fixados com paraformaldeído, e subsequentemente corados com anticorpos contra as proteínas endógenas a motor. De carga e motor imagens fixas são sobrepostos kymographs movimento vivo de "mapa" (colocalize) los para a carga viva movimento trajetórias 16. Correlacionar o movimento vivo das cargas com a associação de proteínas motoras, co-localização é analisado usando um pacote de software MATLAB custom made chamado de "Motor co-localização "16,20. Cargas e motores marcados com fluorescência gerar recursos limitados puntiformes-difração que podem se sobrepõem parcialmente. Para resolver a situação de sobreposição de pontos lacrimais, o primeiro software ajusta automaticamente as funções de Gauss para cada função de dispersão, o que representa puncta fluorescente indivíduo, para determinar a sua posição exacta XY sub-pixel coordena e intensidade amplitudes 21-23. As posições dos motores e cargas são subsequentemente comparados uns com os outros para determinar colocalização 16,20. Por conseguinte, este método atribui mais precisamente entre pontos lacrimais colocalização de fluorescência em comparação com outros métodos de 24.
A robustez do método é a capacidade de avaliar a co-localização dos motores com carga indivíduo em células fixas, para as quais trajectórias de movimento vivos (por exemplo, a direcção em que eles se moviam no momento da fixação) foram recorded. Com este método, cinesinas e dyneins foram encontrados para associar simultaneamente a vesículas que transportam a proteína prião normal (PrP C CELULARES), uma carga que se move neuronalmente enriquecido bidireccionalmente ou permanece estacionário em 16 axónios. Esta análise permitiu a formulação de um modelo de trabalho para a regulamentação da PrP C movimento vesícula em que anterógrada (kinesin) e (dineína) motores retrógradas coordenar suas atividades, a fim de mover as vesículas em qualquer direção ou permanecer parado enquanto associada à carga . Outra força deste método é a sua potencial aplicabilidade ampla para a caracterização de uma co-localização / associação de muitas cargas marcadas com fluorescência que se movem em virtualmente qualquer tipo de célula, com qualquer outra proteína (s) de interesse. Assim, a correlação vivo / fixo poderia potencialmente permitir a detecção de interacções proteína-transientes de carga, como muitos fluorescentemente marcado indivíduo partículas em movimento pode ser analisado ao longo de um p desejareríodo de tempo. Dada a aplicabilidade ampla e do tipo de questões que este método pode resolver, este protocolo vai ser de interesse para um grande público de biólogos celulares, incluindo aqueles que estudam o tráfico eo transporte em neurônios ou em outros tipos de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado permite a correlação de direcionalidade do movimento de partículas fluorescentes de carga em movimento baseado em microtúbulos individuais com o tipo de relação e quantidade de proteínas motoras associadas em neurônios vivos. Anteriormente, a composição do motor total de cargas vesiculares axonal foi analisada em populações heterogêneas de vesículas e organelas 9,15 bioquimicamente purificados. No entanto, a caracterização composição do motor pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Riferimenti
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
