Karakterisera sammansättning Molecular Motors på Moving axonal Cargo Använda "Cargo Mapping" Analys
Summary
Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.
Abstract
Förstå de mekanismer genom vilka molekylära motorer samordna sin verksamhet för att transportera vesikulära laster inom nervceller kräver kvantitativ analys av motor / lastföreningar vid enstaka vesikler nivån. Målet med detta protokoll är att använda kvantitativ fluorescensmikroskopi att korrelera ("karta") position och riktning av förflyttning av levande last till styrelsens sammansättning och relativa mängderna av motorer som är förknippade med samma last. "Cargo kartläggning" består av levande avbildning av fluorescensmärkta laster som rör sig i axoner odlade på mikroflödessystem enheter, följt av kemisk fixering vid inspelning av live-rörelsen, och efterföljande immunofluorescens (IF) färgning av exakt samma axonal regioner med antikroppar mot motorer. Colocalization mellan laster med tillhörande motorer bedöms genom att tilldela delpixel positionskoordinater till motor och lastkanaler, genom att montera Gaussfunktioner till diffraktion-limited punkten spridningsfunktioner som representerar enskilda fluorescerande punktkällor. Fasta last- och motorbilder därefter överlagras på tomter av lasthantering, för att "kartlägga" dem till sina spårade banor. Styrkan i detta protokoll är en kombination av levande och IF data för att spela in både transport av vesikulära laster i levande celler och för att avgöra vilka motorer som är förknippade med dessa exakt samma vesiklar. Denna teknik övervinner tidigare utmaningar som använder biokemiska metoder för att fastställa den genomsnittliga motor sammansättningen av renade heterogena bulk vesikler populationer, eftersom dessa metoder inte avslöjar kompositioner på enskilda rörliga laster. Dessutom kan detta protokoll anpassas för analys av andra transporter och / eller människohandel vägar i andra celltyper för att korrelera förflyttning av enskilda intracellulära strukturer med sin proteinsammansättning. Begränsningar i detta protokoll är den relativt låga genomströmningen på grund av låga transfektionseffektiviteter av odladprimära nervceller och ett begränsat synfält för högupplösta bilder. Framtida applikationer kan omfatta metoder för att öka antalet nervceller som uttrycker fluorescerande laster.
Introduction
Intracellulär transport är kritisk i alla celltyper för leverans av proteiner, membraner, organeller och signalmolekyler till olika cellulära domänerna 1. Nervceller är specialiserade celler med långa, polariserade prognoser som kritiskt beroende av intracellulär transport av viktiga laster för sina långväga leverans till olika axonal mikro. Denna transport förmedlas av kinesiner och dyneins – två stora familjer av molekylära motorproteiner – som binder till last och spåra längs polarise mikrotubuli i antero och bakåtsträvande riktningar, respektive. Medan retrograd rörelse huvudsakligen medieras av dynein är rörelse i anteroriktningen underlättas av ett stort, funktionellt skiftande familj av kinesin motorer. Följaktligen kunde antero transport av axonal laster förmedlas av olika familjemedlemmar i kinesin super 1-5. Även om vissa laster rör sig ständigt i endera riktningen, mOst laster flytta dubbelriktat och vända ofta på väg till sin slutdestination 1,5-13. Vidare har det visat sig att motorerna till motsatta rikt associera samtidigt till last, upp frågan om hur reglerad förflyttning av laster koordineras av motsatt polaritet motorer 5-7. Tillsammans är transport av axonal last en samlad process som regleras av sammansättningen av motorer och deras specifika biokemiska aktiviteter, vilka i sin tur är beroende av olika adaptrar och reglerande bindningspartner 14.
För att troget beskriva mekanismen för axonal transport för en viss last och att avslöja den bakomliggande regleringen av att transporter är det av största vikt att bestämma sammansättningen av motorproteiner och regleringsbindningspartners i samband med enskilda laster under deras live transporten. Andra metoder, exempelvis biokemiska metoder, tillhandahålla beräkningar av genomsnitts MOTeller kompositioner på renade heterogena vesikler populationer, men dessa uppskattningar inte avslöjar vilken typ eller mängd motorer är associerade till enstaka rörliga vesiklar. Även beredning av vesikler transporter längs förmonterade mikrotubuli in vitro aktiverad mäta mängden en typ av motor på en vesikler nivå 15. Emellertid har dessa försök som inte direkt korrelerar antalet motorer med transport egenskaperna hos dessa vesiklar, och mätte transport i frånvaro av cellulära regulatoriska faktorer.
Ett protokoll presenteras här, som bestämmer motorsammansättningen (typ och relativa mängden av motorer) individuella rörliga vesiklar från immunofluorescens (IF) uppgifter som mäter endogent uttryckt motorproteiner, och korrelerar dessa parametrar för transport av levande exakt samma blåsor i nervceller 16. Metoden innebär noggrann kartläggning av IF-to-live lasthantering uppgifter. Detta åstadkommes genom att growing hippocampus mus nervceller i mikrofluidikanordningar följande etablerade protokoll 17 till 19. Dessa enheter kan för identifiering och korrelation ("mapping") av axoner och enskilda rörliga laster inom fast och levande ljus mikroskopi modaliteter (Figur 1). Odlade nervceller transfekteras med fluorescerande last proteiner vars transport avbildas med hög spatial och temporal upplösning för att få detaljerad rörlighet för information som är avsatt i kymographs. Under loppet av avbildning, är neuroner fixerades med paraformaldehyd och färgades därefter med antikroppar mot endogena motorproteiner. Fasta last- och motorbilder över på levande rörelse kymographs till "karta" (colocalize) dem till levande lasthantering banorna 16. För att korrelera den levande rörelsen av laster med sammanslutning av motorproteiner, är colocalization analyseras med hjälp av en specialtillverkad MATLAB programpaket som kallas "Motor colocalization "16,20. Fluorescerande laster och motorer genererar diffraktionsbegränsad punktat funktioner som delvis kan överlappa varandra. För att lösa placeringen av överlappande puncta passar programvaran först automatiskt Gaussfunktioner till varje punktspridningsfunktion, som representerar enskilda fluorescerande puncta, för att fastställa deras exakta XY delpixel positionskoordinater och intensitet amplituder 21-23. Positionerna för motorer och last är Därefter jämförs med varandra för att avgöra colocalization 16,20. Därför kan denna metod tilldelar mer exakt colocalization mellan fluorescerande puncta jämfört med andra metoder 24.
Styrkan med denna metod är förmågan att bedöma colocalization av motorer med individuell last i fasta celler, där levande rörelsebanor (t.ex. i vilken riktning de rör sig vid tidpunkten för fixering) har recorded. Med denna metod har kinesiner och dyneins fann att associera samtidigt till blåsor som bär det normala prionproteinet (PrP C -cellular), ett neuronalt berikat last som rör sig i två riktningar eller förblir stillastående i axoner 16. Denna analys tillät utformningen av en arbetsmodell för reglering av PrP C vesikelns rörelse där antero (kinesin) och bakåtsträvande (dynein) motorer samordna sin verksamhet för att kunna flytta blåsor i endera riktningen eller att stå stilla medan associerade till lasten . En annan styrka med denna metod är dess potentiella bred tillämpning för att karakterisera colocalization / sammanslutning av många fluorescerande laster som rör sig i stort sett varje celltyp, med något annat protein (er) av intresse. Således kunde leva / fast korrelation potentiellt kan påvisas av transienta proteinlast interaktioner, kan så många enskilda fluorescerande rörliga partiklar analyseras över en önskad period av tiden. Med tanke på den breda tillämplighet och den typ av frågor som denna metod kan hantera, kommer detta protokoll vara av intresse för en bred publik av cellbiologer inklusive de som studerar handel och transport i nervceller eller andra celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet presenteras här möjliggör korrelation av riktnings rörligheten för enskilda fluorescerande mikrotubuli baserade rörliga lastpartiklar med den relativa typen och mängden av tillhörande motor proteiner i levande neuroner. Tidigare var den totala motor sammansättningen av axonal vesikulära laster analyseras på heterogena populationer av biokemiskt renade blåsor och organeller 9,15. Dock har kännetecknar motorsammansättningen för en enda typ av last inuti cell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.
Materials
| Reagent and Equipment Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1X) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1X) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100X) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1X) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1X) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24X40mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | N/A | |
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | N/A | |
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16 ), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymoraph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. |
Riferimenti
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).
