جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الضمور العضلي المرضى: كفاءة خالية من التكامل إعادة برمجة الخلايا المستمدة البول
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
اعتلال عضلة القلب التصنع هو نتيجة غير مفهومة من الضمور العضلي. توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) من المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات هو مصدر الخلوي لا يقدر بثمن لفي المختبر أنظمة نموذج المرض، ويمكن استخدامها للدراسات فحص المخدرات. وقد استخدمت خلايا البول المستمدة من المريض في إعادة برمجة ناجحة في الخلايا الجذعية المحفزة من أجل نموذج اعتلال عضلة القلب حثلي 1. معالجة مخاوف تتعلق بالسلامة دمج أنظمة النواقل، نقدم بروتوكول باستخدام غير دمج-سينداي ناقلات الفيروس لتنبيغ ياماناكا العوامل في خلايا البول التي جمعت من المرضى الذين يعانون من الضمور العضلي. هذا البروتوكول يولد برمجتها بالكامل الحيوانات المستنسخة في غضون 2-3 أسابيع. الخلايا المحفزة هي خالية من متجه من قبل مرور 13. يمكن التفريق بين هذه iPSCs التصنع في العضلية وتستخدم إما لدراسة آليات المرض أو لفحص المخدرات.
Introduction
اعتلال عضلة القلب هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في المرضى الذين يعانون من دوشين وبيكر ضمور العضلات (MD). على الرغم من أن الطفرات في العاشر مرتبطة الدستروفين الجينات تحدث في 1: 3،500 المواليد الذكور، والقليل جدا هو المعروف عن الأحداث الجزيئية والخلوية مما يؤدي إلى تلف العضلات التدريجي القلب. وظهرت الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان المستمدة من مرضى ضمور العضلات كأداة جديدة لدراسة آليات المرض الكامنة واستخدامها لفحص المخدرات 1،2.
عدم الراحة المتوقعة من خزعات الجلد أو عينات الدم قد يثني المرضى الصغار و / أو أولياء أمورهم لإعطاء الموافقة للمشاركة الدراسة. عينات البول هي مصدر غير الغازية من الخلايا الجسدية التي هي قابلة للتعديل لأساليب إعادة برمجة. لقد أظهرنا مؤخرا أن الخلايا البول التي جمعت من مرضى ضمور العضلات قد يكون مثقف وكفاءة برمجتها في iPSCs باستخدام تنبيغ فيروسات مع العوامل ياماناكا (Oct3 / 4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. OSKM) 1. وعيب توصيل الجينات فيروسات هو دمج عشوائي من الجينات إعادة برمجة في الكروموسومات المضيف. للتغلب على هذا القيد، وقد استخدمنا غير دمج الفيروسات سينداي لإعادة برمجة خلايا البول.
هذا البروتوكول تفاصيل إعادة برمجة فيروس سينداي الخلايا البول معزولة من مرضى ضمور العضلات ومن ثم يمكن متباينة في العضلية أو أنواع الخلايا الأخرى لمزيد من الدراسة. ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأمراض محددة المريض الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
نمذجة أمراض القلب والشرايين باستخدام iPSCs أصبحت نهج مشترك لفهم مساهمة الوراثية 4-6. بعض الصعوبات غير المتوقعة من الحصول على عينات من خلايا المرضى، خاصة الأطفال الصغار، ويمكن تجنبها من خلال تقديم خيار نهج غير الغازية مثل جمع البول. في هذه الفئة من السكان الشباب ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
