Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
Dystrophischen Kardiomyopathie ist eine schlecht verstanden Folge der Muskeldystrophie. Generieren von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten mit Muskeldystrophie ist eine unschätzbare Quelle für zelluläre in vitro Krankheitsmodellsysteme und für Wirkstoff-Screening-Studien verwendet werden. Patienten stammenden Urinzellen in erfolgreiche Reprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen, um dystrophischen Kardiomyopathie Muster 1 verwendet. Adressieren der Sicherheitsbedenken von integrierenden Vektor-Systeme, unter Verwendung eines nicht-integrierenden Sendai-Virus-Vektors für die Transduktion von Yamanaka Faktoren in den Urin-Zellen von Patienten mit Muskeldystrophie gesammelt präsentieren wir ein Protokoll. Dieses Protokoll erzeugt vollständig neu programmiert Klone innerhalb von 2-3 Wochen. Die pluripotenten Zellen sind vektorfreien Durchgang durch-13. Diese dystrophischen iPS-Zellen lassen sich in Herzmuskelzellen differenziert und entweder verwendet werden, um Krankheitsmechanismen und für Wirkstoff-Screening zu untersuchen.
Introduction
Kardiomyopathie ist die zweithäufigste Todesursache bei Patienten mit Duchenne und Becker-Muskeldystrophie (MD). Obwohl Mutationen in dem X-verknüpften Dystrophin-Gen in 1 auftreten: 3,500 männlichen Neugeborenen, ist sehr wenig über die molekularen und zellulären Ereignisse, die zum fortschreitenden Herzmuskelschäden bekannt. Menschen induzierte pluripotente Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten stammen, wurden als neuartige Instrument, um die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen zu studieren und für Wirkstoff-Screening 1,2 verwenden entstanden.
Die erwartete Beschwerden von Hautbiopsien oder Blutproben kann jungen Patienten und / oder ihrer Erziehungsberechtigten davon abzubringen, die Einwilligung zur Studienteilnahme zu geben. Urinproben ein nicht-invasives Quelle somatischer Zellen, abänderbar Neuprogrammierung Methoden. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Urin Zellen von Muskeldystrophie Patienten gesammelt wurden, können kultiviert werden und effizient in iPSCs Hilfe retroviraler Transduktion mit den Yamanaka Faktoren (umprogrammiertOCT3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc; OSKM) 1. Der Nachteil der retroviralen Gentransfer ist die zufällige Integration der Umprogrammierung Gene in die Wirtschromosomen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir das nicht-integrierenden Sendaivirus zur Urin Reprogrammierung verwendet.
Dieses Protokoll beschreibt die Sendai-Virus Reprogrammierung von Zellen aus Urin isoliert Muskeldystrophie-Patienten, die dann in Herzmuskelzellen oder anderen Zelltypen für eine weitere Studie unterschieden werden können. Dieses Protokoll kann auch für andere Patienten spezifischen Krankheiten angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modellierung von Herzkreislauferkrankungen mit iPS-Zellen entwickelt sich zu einem gemeinsamen Ansatz für den genetischen Beitrag 4-6 zu verstehen. Einige unerwartete Schwierigkeiten, die einem Zellproben von Patienten, insbesondere junge Kinder, können, indem sie die Möglichkeit einer nichtinvasiven Ansatz wie einer Urinsammlung vermieden werden. In diesem jungen Patientengruppe ist es oft schwierig, eine Urinvolumen ausreichend zu sammeln, um genügend Zellen zur Reprogrammierung Urin ergeben. Coaching d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
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