Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
Cardiomiopatía distrófica es una consecuencia mal entendido de la distrofia muscular. Generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes con distrofia muscular es una fuente inestimable para celular in vitro sistemas modelo de la enfermedad y puede ser utilizado para los estudios de detección de drogas. Células de orina derivados de los pacientes se han utilizado con éxito en la reprogramación de las células madre pluripotentes inducidas con el fin de modelar la miocardiopatía distrófica 1. Abordar los problemas de seguridad de la integración de sistemas de vectores, se presenta un protocolo utilizando un vector de virus Sendai no integrador para la transducción de Yamanaka factores en las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular. Este protocolo genera clones reprogramado completamente dentro de 2-3 semanas. Las células pluripotentes son libre de vectores mediante el paso-13. Estos iPSCs distróficos pueden diferenciarse en cardiomiocitos y se utilizan ya sea para estudiar mecanismos de la enfermedad o para la detección de drogas.
Introduction
La cardiomiopatía es la segunda causa principal de muerte en pacientes con distrofia muscular de Duchenne y de Becker (MD). Aunque las mutaciones en el gen de la distrofina ligada al cromosoma X se producen en 1: 3.500 nacimientos de varones, se sabe muy poco acerca de los eventos moleculares y celulares que conducen al daño del músculo cardíaco progresivo. Las células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de pacientes con distrofia muscular se han convertido en una nueva herramienta para estudiar los mecanismos subyacentes de la enfermedad y que se utilizará para la detección de drogas 1,2.
La incomodidad anticipada de biopsias de piel o muestras de sangre puede disuadir a los pacientes jóvenes y / o sus tutores para dar su consentimiento para participar en el estudio. Las muestras de orina son una fuente no invasiva de células somáticas que son modificables a los métodos de reprogramación. Recientemente hemos demostrado que las células de orina recogidas de pacientes con distrofia muscular pueden ser cultivadas y eficiente reprogramado en iPSCs utilizando la transducción retroviral con los factores de Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc; OSKM) 1. La desventaja del suministro de genes retrovirales es la integración aleatoria de los genes de reprogramación en los cromosomas del huésped. Para superar esta limitación, hemos utilizado el virus Sendai no integrante de la reprogramación celular orina.
Este protocolo detalla la reprogramación de virus Sendai de células aisladas de orina de pacientes con distrofia muscular que a su vez pueden diferenciarse en cardiomiocitos u otros tipos de células para su posterior estudio. Este protocolo también se puede adaptar para otras enfermedades específicas del paciente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelado de las enfermedades cardiovasculares mediante iPSCs se está convirtiendo en un enfoque común de entender la contribución genética 4-6. Algunas dificultades no previstas de la obtención de muestras de células de los pacientes, especialmente los niños pequeños, se pueden evitar al ofrecer la opción de un método no invasivo, como una muestra de orina. En esta población joven paciente, a menudo es difícil recoger un volumen de orina suficiente para producir suficientes células de orina para …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
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