Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
Dystrofische cardiomyopathie is een slecht begrepen gevolg van spierdystrofie. Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van patiënten met spierdystrofie is een waardevolle cellulaire bron in vitro ziekte modelsystemen en kan worden gebruikt voor drug discovery studies. -Patiënt afgeleid urine cellen zijn gebruikt in succesvolle herprogrammering in geïnduceerde pluripotente stamcellen om te modelleren dystrophic cardiomyopathie 1. Het aanpakken van de bezorgdheid over de veiligheid van de integratie van vector systemen, presenteren we een protocol met behulp van een niet-integrerende Sendaivirusvector voor transductie van Yamanaka factoren in de urine cellen verzameld van patiënten met spierdystrofie. Dit protocol genereert volledig geherprogrammeerd klonen binnen 2-3 weken. De pluripotente cellen zijn vectorvrij door passage-13. Deze dystrofische iPSCs kunnen worden onderscheiden in hartspiercellen en gebruikt worden om de ziekte mechanismen of voor drug discovery bestuderen.
Introduction
Cardiomyopathie is de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij patiënten met Duchenne en Becker spierdystrofie (MD). Hoewel mutaties in het X-gebonden dystrofine-gen optreden bij 1: 3.500 mannelijke geboortes, zeer weinig bekend over de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die leiden tot progressieve hartspier schade. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van spierdystrofie patiënten hebben ontpopt als een nieuwe gereedschap om de onderliggende ziekte mechanismen bestuderen en te gebruiken voor drug discovery 1,2.
De verwachte ongemak van huidbiopsies of bloedmonsters kunnen jonge patiënten en / of hun verzorgers ontmoedigen om toestemming voor deelname aan het onderzoek te geven. Urinemonsters zijn een non-invasieve bron van somatische cellen die amendeerbaar tot herprogrammering methoden zijn. We hebben onlangs aangetoond dat urine cellen verzameld van spierdystrofie patiënten gekweekt kan zijn en efficiënt geprogrammeerd in iPSCs behulp van retrovirale transductie met de Yamanaka factoren (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, en c-Myc; OSKM) 1. Het nadeel van retrovirale genoverdracht is de willekeurige integratie van de herprogrammering genen in de gastheer chromosomen. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij de niet-integrerende Sendai virus urine cel herprogrammering gebruikt.
Dit protocol geeft de Sendai virus herprogrammering van urine geïsoleerde cellen van spierdystrofie patiënten die vervolgens kunnen worden onderscheiden in cardiomyocyten of andere celtypes voor verdere studie. Dit protocol kan ook worden aangepast voor andere patiënten specifieke ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelleren van hart- en vaatziekten met behulp van iPSCs wordt steeds meer een gemeenschappelijke aanpak van de genetische bijdrage 4-6 begrijpen. Sommige onverwachte moeilijkheden om celmonsters van patiënten, met name jonge kinderen, kunnen worden vermeden door het aanbieden van de mogelijkheid van een niet-invasieve benadering zoals urine inzameling. In deze jonge patiëntenpopulatie, is het vaak moeilijk een voldoende hoeveelheid urine verzamelen voldoende urine cellen opleveren herprogrammering. Coachen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
