This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Dystrophic कार्डियोमायोपैथी पेशी dystrophy के खराब समझ परिणाम है। पेशी dystrophy के साथ रोगियों से प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) पैदा करने के लिए इन विट्रो रोग मॉडल प्रणाली के लिए एक अमूल्य सेलुलर स्रोत है और दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रोगी व्युत्पन्न मूत्र कोशिकाओं dystrophic कार्डियोमायोपैथी 1 मॉडल के क्रम में प्रेरित स्टेम कोशिकाओं में सफल reprogramming में इस्तेमाल किया गया है। वेक्टर प्रणालियों को एकीकृत करने की सुरक्षा चिंताओं को संबोधित करते हुए हम यामानाका के पारगमन पेशी dystrophy के साथ रोगियों से एकत्र मूत्र कोशिकाओं में कारकों के लिए एक गैर समेकित करने सेंडाइ वायरस वेक्टर का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल पूरी तरह से 2-3 सप्ताह के भीतर क्लोन reprogrammed उत्पन्न करता है। pluripotent कोशिकाओं बीतने-13 के द्वारा वेक्टर से मुक्त हैं। ये dystrophic IPSCs cardiomyocytes में भेदभाव और रोग तंत्र या दवा स्क्रीनिंग के लिए अध्ययन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
कार्डियोमायोपैथी डचेन और बेकर पेशी dystrophy (एमडी) के साथ रोगियों में मृत्यु का दूसरा प्रमुख कारण है। एक्स-लिंक्ड डिस्ट्रोफ़िन जीन में परिवर्तन एक में होते हैं हालांकि: 3500 पुरुष जन्म, बहुत कम प्रगतिशील हृदय की मांसपेशी क्षति के लिए अग्रणी आणविक और सेलुलर घटनाओं के बारे में जाना जाता है। पेशी dystrophy रोगियों से ली गई मानव प्रेरित स्टेम सेल अंतर्निहित रोग तंत्र का अध्ययन करने और दवा 1,2 स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक उपन्यास उपकरण के रूप में उभरा है।
त्वचा बायोप्सी या रक्त के नमूनों के प्रत्याशित असुविधा अध्ययन भागीदारी के लिए सहमति देने के लिए युवा रोगियों और / या उनके अभिभावकों विरत हो सकता है। मूत्र के नमूने reprogramming के तरीकों को सुधारने योग्य हैं कि दैहिक कोशिकाओं के एक गैर इनवेसिव स्रोत हैं। हमने हाल ही में पेशी dystrophy रोगियों से एकत्र मूत्र कोशिकाओं सुसंस्कृत हो सकता है कि दिखाया गया है और कुशलता से यामानाका कारकों के साथ रेट्रोवायरल पारगमन का उपयोग कर IPSCs (में reprogrammed किया हैOct3 / 4, Sox2, Klf4, और सी-Myc; OSKM) 1। रेट्रोवायरल जीन डिलीवरी का नुकसान मेजबान गुणसूत्रों में reprogramming जीनों के यादृच्छिक एकीकरण है। इस सीमा को पार करने के लिए, हम मूत्र सेल reprogramming के लिए गैर समेकित करने सेंडाइ वायरस का इस्तेमाल किया है।
इस प्रोटोकॉल फिर आगे के अध्ययन के लिए cardiomyocytes या अन्य प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है जो पेशी dystrophy रोगियों से अलग मूत्र कोशिकाओं के सेंडाइ वायरस reprogramming के विवरण देता है। इस प्रोटोकॉल भी अन्य रोगी विशिष्ट रोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
IPSCs का उपयोग कर हृदय रोगों मॉडलिंग आनुवंशिक योगदान 4-6 समझने के लिए एक साझा दृष्टिकोण होता जा रहा है। रोगियों से सेल के नमूने प्राप्त करने के कुछ अप्रत्याशित कठिनाइयों, विशेष रूप से युवा बच्चों, इस तर?…
The authors have nothing to disclose.
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
List of Materials | |||
Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
List of Antibodies | |||
Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB |