Generasjon av Induced Pluripotent Stamceller fra muskeldystrofi Pasienter: Effektiv integrasjon fritt Omprogrammering av urin Avledet Cells
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
Dystrofe kardiomyopati er en dårlig forstått konsekvens av muskeldystrofi. Generere induserte Pluripotent stamceller (iPSCs) fra pasienter med muskeldystrofi er en uvurderlig mobilnettet kilde for in vitro sykdom modellsystemer og kan brukes for narkotika screening studier. Pasient-avledet urin celler er blitt anvendt i vellykket omprogrammering i induserte pluripotente stamceller for å modellere en dystrofiske kardiomyopati. Adressering sikkerhet bekymringer med å integrere vektorsystemer, presenterer vi en protokoll med et ikke-integrere Sendai virusvektor for transduksjon av Yamanaka faktorer inn i urin celler hentet fra pasienter med muskeldystrofi. Denne protokollen genererer fullt omprogrammeres kloner i løpet av 2-3 uker. De pluripotente celler er vektor-fri ved passasje-13. Disse dystrofiske iPSCs kan differensieres i kardiomyocytter og brukes enten for å studere sykdomsmekanismer eller for narkotika screening.
Introduction
Kardiomyopati er den nest største årsaken til dødsfall hos pasienter med Duchenne og Becker muskeldystrofi (MD). Selv om mutasjoner i X-linked dystrofingenet oppstå i en: 3500 mannlige fødsler, er svært lite kjent om de molekylære og cellulære hendelser som fører til progressiv hjertemuskelskader. Menneskeskapte pluripotente stamceller hentet fra muskeldystrofi pasienter har dukket opp som en roman verktøy for å studere de underliggende sykdomsmekanismer og å bruke for narkotika screening 1,2.
Den forventede ubehag av hud biopsier eller blodprøver kan fraråde unge pasienter og / eller deres foresatte til å gi samtykke til studiedeltakelse. Urinprøver er en ikke-invasiv kilde for somatiske celler, som er foranderlig i reprogrammerings-metoder. Vi har nylig vist at urin celler hentet fra muskeldystrofi pasienter kan være kultivert og effektivt omprogrammeres til iPSCs bruker retrovirale transduksjon med Yamanaka faktorer (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, og c-Myc; OSKM) 1. Ulempen med retrovirale genavlevering er tilfeldig integrering av reprogrammerings-gener inn i vertens kromosom. For å overvinne denne begrensningen, har vi brukt den ikke-integrere Sendai virus for urin celle omprogrammering.
Denne protokollen beskriver Sendai virus omprogrammering av isolerte urin celler fra muskeldystrofi pasienter som deretter kan differensieres i kardiomyocytter eller andre celletyper for videre studier. Denne protokollen kan også tilpasses for andre pasientspesifikke sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modellering kardiovaskulære sykdommer ved hjelp iPSCs blir en felles tilnærming for å forstå den genetiske bidraget 4-6. Noen uventede vanskeligheter med å skaffe celleprøver fra pasienter, særlig små barn, kan unngås ved å tilby muligheten av en ikke-invasiv metode for eksempel en urinoppsamling. I denne unge pasientpopulasjon, er det ofte vanskelig å samle et volum av urin som er tilstrekkelig til å gi nok urin celler for omprogrammering. Coaching de unge pasientene å drikke 30 min før urinen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
