Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
Cardiomiopatia distrófica é uma consequência pouco compreendido de distrofia muscular. Geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) de pacientes com distrofia muscular é uma fonte inestimável para celular in vitro sistemas modelo doença e pode ser usado para estudos de pesquisa de fármacos. Células derivadas de urina de doentes foram utilizadas na reprogramação em células estaminais pluripotentes induzidas, a fim de modelar cardiomiopatia distrófica 1. Responder às preocupações de segurança de integração de sistemas de vectores, apresentamos um protocolo usando um Sendai vetor do vírus não-integração para a transdução de Yamanaka fatores em células de urina coletadas de pacientes com distrofia muscular. Este protocolo gera clones totalmente reprogramado dentro de 2-3 semanas. As células pluripotentes são livres do vetor por passagem-13. Essas iPSCs distróficos podem se diferenciar em cardiomiócitos e usado tanto para estudar mecanismos de doença ou para o rastreio de drogas.
Introduction
Cardiomiopatia é a segunda principal causa de morte em pacientes com distrofia muscular de Duchenne e Becker (MD). Embora as mutações no gene da distrofina ligada a X ocorrer em 1: 3500 nascimentos do sexo masculino, muito pouco se sabe sobre os eventos moleculares e celulares que levam a lesão do músculo cardíaco progressivo. As células estaminais pluripotentes humanas induzida derivadas de pacientes com distrofia muscular emergiram como uma nova ferramenta para o estudo dos mecanismos patológicos subjacentes e usar-se para o rastreio de drogas 1,2.
O desconforto antecipada de biópsias de pele ou amostras de sangue pode dissuadir jovens pacientes e / ou seus responsáveis para dar o seu consentimento para participação no estudo. As amostras de urina são uma fonte não-invasivo de células somáticas que são alteráveis a métodos de reprogramação. Mostrámos recentemente que células de urina colhidas de pacientes com distrofia muscular podem ser cultivadas eficientemente e reprogramado em iPSCs utilizando transdução retroviral com os factores (YamanakaOCT3 / 4, Sox2, KLF4, e c-Myc; OSKM) 1. A desvantagem de entrega de genes retrovirais é a integração aleatória de genes de reprogramação em cromossomas hospedeiros. Para superar essa limitação, temos usado o vírus não-integração Sendai para a reprogramação celular urina.
Este protocolo detalha a reprogramação vírus Sendai de células isoladas de urina de pacientes com distrofia muscular, que pode então ser diferenciadas em cardiomiócitos e outros tipos de células para um estudo mais aprofundado. Este protocolo pode também ser adaptado para outras doenças específicas de pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelando doenças cardiovasculares usando iPSCs está se tornando uma abordagem comum para compreender a contribuição genética 4-6. Algumas dificuldades imprevistas de obtenção de amostras de células de pacientes, especialmente crianças pequenas, pode ser evitada, oferecendo a opção de uma abordagem não-invasiva, como uma coleta de urina. Nessa população jovem paciente, muitas vezes é difícil coletar um volume de urina suficiente para produzir células de urina suficiente para a reprogramação…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
Riferimenti
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