Isolering af Distinct cellepopulationer fra udviklingslandene lillehjernen ved mikrodissektion

Summary

Nestin-udtrykkende progenitorer er en nyligt identificerede population af neuronale stamceller i det udviklende cerebellum. Ved hjælp af mikrodissektion teknik præsenteres her i kombination med fluorescerende cellesortering, kan denne cellepopulation oprenses uden kontaminering fra andre cerebellare regioner og kan dyrkes til yderligere undersøgelser.

Abstract

Mikrodissektion er en ny teknik, der kan isolere specifikke områder af et væv og eliminere forurening fra cellulære kilder i tilstødende områder. Denne fremgangsmåde blev først anvendt i studiet af Nestin-udtrykkende progenitorer (Neps), en nyligt identificerede population af celler i cerebellum ydre vækstlag (EGL). Brug mikrodissektion i kombination med fluorescerende cellesortering (FACS) blev en ren population af Neps indsamles separat fra konventionelle granule neuron prækursorer i EGL og fra andre kontaminerende Nestin-udtrykkende celler i cerebellum. Uden mikrodissektion ville funktionelle analyser af Neps ikke have været muligt med de nuværende metoder til rådighed, såsom Percoll gradientcentrifugering og laser capture mikrodissektion. Denne teknik kan også anvendes til brug med forskellige væv, der indeholder enten genkendelige regioner eller fluorescens-mærkede celler. Vigtigst er det, en stor fordel ved denne microdissection teknik er, at isolerede celler er levende og kan dyrkes til yderligere eksperimenter, som i øjeblikket ikke er muligt med andre beskrevne metoder.

Introduction

Lillehjernen består af flere cellelag, som hver indeholder forskellige celletyper. Under udvikling, indeholder EGL prolifererende granulat neuron forstadier (BNI), mens den molekylære lag og Purkinje lag indeholder Bergmann Glia og Purkinje neuroner hhv. Dybt i lillehjernen ligger den hvide substans, der indeholder neurale stamceller (NSC) og oligodendrocytter ^1.

Sonic pindsvin (Shh) spiller en afgørende rolle i reguleringen af cerebellar udvikling og i særdeleshed det fremmer udbredelsen af BNI via binding til sin receptor Patched (PTC), en negativ regulator af Shh signalering ^2-4. Afvigende aktivering af Shh signalering genererer medulloblastoma (MB), den mest almindelige maligne hjernetumor hos børn ^5,6.

PTC mutant MB transgene musemodeller er stærke værktøjer til studiet af MB og udvikle tumorer ligner menneskelig MB ^7,8. Ved hjælp af dissemus, blev det opdaget, at BNI er cellen af oprindelse for pindsvin-typen MB ^7. Endvidere, ud over BNI, har vi for nylig identificeret en unik population af neuronale progenitorceller inden EGL af udviklingen i lillehjernen, der også kan give anledning til MB. Disse celler udtrykker høje niveauer af typen VI mellemliggende filamentprotein, Nestin, og kaldes Neps ^9. Neps ligger inden for den dybe del af EGL og findes transient kun i neonatal cerebellare udvikling. De er forpligtet til at granulatet cellelinje som BNI, men adskiller sig, som de er i hvile og ikke udtrykker Math1, et veletableret markør for konventionelle BNI ^10. Desuden Neps give anledning til MB mere effektivt end BNI efter aktivering af Shh signalvejen ^9, hvilket gør dem et hidtil ukendt oprindelse til MB tumorigenese.

Vi har tidligere isolerede Neps fra cerebellare EGL på postnatal dag 4 (P4) ved mikrodissektion teknikher ⁹ beskrevne. Mikrodissektion via direkte mikroskopisk visualisering af væv giver mulighed for specifik dissektion af cerebellare EGL. Dette er nødvendigt, da Nestin også udtrykkes ved NSC i cerebellare hvide substans og ved Bergmann glia i den molekylære lag ^1,7,11,12, og det var afgørende, at disse celler ikke medtages, da de ville forvirre analyse. Celler isoleret fra Mikrodissekterede væv umiddelbart kan anvendes til molekylær analyse, eller de kan dyrkes til yderligere anvendelser.

For at hjælpe i specielt microdissecting EGL og til yderligere oprensning Neps blev Math1-GFP (grønt fluorescerende protein) mus krydset med Nestin-fælles fiskeripolitik (cyan fluorescerende protein) mus. Transkriptionsfaktoren Math1 specifikt udtrykt af BNI, og GFP-ekspression er tydeligt i EGL ^9,13. Mus Nestin-FFP udtrykker en nuklear form for fælles fiskeripolitik og kan nemt visualiseres i den molekylære lag ^9,14. Sammen GFP og FFP ekspression skabe grænser for mikrodissektion af EGL (se figur 1). FFP-positive Neps blev derefter isoleret ved FACS efter enzymatisk dissociering af dissekerede EGLS.

I øjeblikket er den mest anvendte metode til at isolere celler fra EGL er Percoll-gradientcentrifugering af hele cerebellar væv ^15,16. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke i stand til helt at udelukke Nestin +-cellepopulationer fra det molekylære lag og hvid substans, og derfor ikke kan anvendes til undersøgelse af Neps. Laser capture microdissection, som bruger overførsel af laserenergi til fjernelse af celler af interesse, er en anden metode, der anvendes til at isolere specifikke celler i en heterogen væv ^17,18 men indfangede celler kan kun anvendes til udvinding af DNA, RNA og protein og er ikke stand til at blive dyrket.

Denne protokol giver en måde til specifikt at isolere en levende, ren population af Neps fra EGL.Denne teknik kan også anvendes på forskellige vævstyper, der enten genkendelige anatomiske arkitektur eller fluorescensmærkede celler / områder. Derfor er den største fordel ved at inkorporere denne nye mikrodissektion teknik i celleisolering protokoller er, at cellerne kan isoleres fra bestemte vævsområder at fjerne kontaminerende tilstødende væv og cellerne kan opsamles umiddelbart til analyse eller dyrkes til andre anvendelser.

Protocol

Anvendelse af dyr i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med procedurer, der er godkendt af Fox Chase Cancer Center Animal Care og brug Udvalg. 1. Fremstilling af instrumenter, løsninger og Dækglas Clean to sæt af # 5 fine pincet, et sæt af # 7 fine buet pincet, et stort kirurgisk saks, en microdissecting saks, en spatel og en hulske. Anbring instrumenterne i en selvlukkende sterilisering pose og autoklave. Hold instrumenter pose indtil den er klar til brug. </l…

Representative Results

Som vist i figur 1A blev cerebellare skiver fremstillet ud fra P4 Math1-GFP-mus / Nestin-FFP, hvor cerebellare EGL var domineret af GFP-udtrykkende BNI og den molekylære lag blev beriget med FFP-positive glialceller. Til isolering Neps der er placeret i den dybe del af EGL, blev skiver mikrodissekeres mellem EGL og den molekylære lag (langs stiplet linje, figur 1A). Dissekeret EGLS (figur 1B), blev derefter opsamlet enzymatisk dissociation efterfulgt…

Discussion

Den her beskrevne mikrodissektion metode er den første procedure stand til at isolere en ren population af levende celler til anvendelse i molekylære og funktionelle analyser. Som det fremgår af Li et al. ^9. Neps opnået ved denne metode kan dyrkes og inkorporeres i forskellige eksperimenter og på grund af deres høje renhed, kan også anvendes til microarray analyse.

Det er meget vigtigt at tage tid til at blive dygtige med denne mikrodissektion teknik. Ne…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144