בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection
Summary
אבות להביע Nestin הם אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של אבות עצביים במוח הקטן מתפתח. שימוש בטכניקת microdissection מוצגת כאן בשילוב עם מיון תא הופעל ניאון, אוכלוסיית תא זו יכולה להיות מטוהרת ללא זיהום מאזורים אחרים של מוח קטנים ויכולה להיות מתורבת למחקרים נוספים.
Abstract
Microdissection הוא שיטה חדשנית שיכול לבודד אזורים ספציפיים של רקמות ולמנוע זיהום ממקורות סלולריים באזורים סמוכים. שיטה זו נוצלה לראשונה במחקר של אבות (NEPs) להביע Nestin, אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של תאים בשכבה החיצונית של המוח הקטן הנבטיה (EGL). באמצעות microdissection בשילוב עם מיון המופעל ניאון תא (FACS), אוכלוסייה טהורה של NEPs נאספה בנפרד ממבשרי נוירונים גרגיר קונבנציונליים בEGL ומתאים מזהמים אחרים Nestin להביע במוח הקטן. ללא microdissection, ניתוחים תפקודיים של NEPs לא היו אפשריים עם השיטות הנוכחיות זמינות, כגון צנטריפוגה שיפוע Percoll וmicrodissection ללכוד לייזר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לשימוש עם רקמות שונות המכילות גם אזורים מוכרים או תאי fluorescently שכותרתו. והכי חשוב, יתרון עיקרי של microdissectio זהטכניקת n היא שתאים מבודדים חיים ויכולים להיות מתורבת לניסויים נוספים, שנמצא כרגע לא אפשרי עם שיטות שתוארו אחרות.
Introduction
המוח הקטן מורכב משכבות תאים מרובות, כל סוגי תאים שונים המכילים. במהלך פיתוח, EGL מכיל מתרבים מבשרי נוירונים גרגיר (GNPs) ואילו השכבה המולקולרית ושכבת פורקינג מכילים נוירונים גליה ברגמן ופורקינג, בהתאמה. עמוק בתוך המוח הקטן נמצא חומר הלבן, אשר מכיל תאי גזע עצביים (NSCs) וoligodendrocytes 1.
קיפוד סוניק (ששש) משחק תפקיד קריטי בויסות התפתחות המוח הקטן ובפרט, זה מקדם את ההתפשטות של GNPs באמצעות קשירה לקולטן שלו טלוא (PTC), רגולטור שלילי של ששש איתות 2-4. הפעלה חריגה של איתות ששש מייצרת מדולובלסטומה (MB), גידול במוח הממאיר השכיח ביותר בילדים 5,6.
מודלים עכבר PTC MB המוטציה מהונדסים הם כלים רבי עוצמה ללימוד MB ולפתח גידולים דומים MB האנושי 7,8. באמצעות אלהעכברים, התגלו כי GNPs הוא התא ממוצא לקיפוד מהסוג MB 7. יתר על כן, בנוסף לGNPs, יש לנו לאחרונה זיהו אוכלוסייה ייחודית של אבות עצביים בתוך EGL של המוח הקטן ומתפתח, שיכול גם לגרום לMB. תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של החלבון מסוג VI נימה ביניים, Nestin, ומכונים NEPs 9. NEPs נמצא בתוך החלק העמוק של EGL וקיים זמני בלבד במהלך התפתחות המוח הקטן בילוד. הם מחויבים לשושלת תא גרגיר כGNPs אבל נבדלים כפי שהם שקטים ולא מבטאים את Math1, סמן מבוסס היטב לGNPs הקונבנציונלי 10. בנוסף, NEPs להצמיח MB יעילות רב יותר מאשר GNPs לאחר ההפעלה של המסלול ששש איתות 9, שהופך אותם מקור חדש ליצירת גידולי MB.
בודדנו בעבר NEPs מEGL המוח הקטן ביום הלידה 4 (P4) על ידי טכניקת microdissectionמתואר כאן 9. Microdissection באמצעות הדמיה מיקרוסקופית ישירה של הרקמות מאפשר לנתיחה ספציפית של EGL המוח הקטן. זה הוא הכרחי מכיוון Nestin בא לידי ביטוי גם על ידי NSCs בחומר הלבן במוח הקטן ועל ידי גליה ברגמן בשכבה המולקולרית 1,7,11,12 וזה היה קריטי, כי תאים אלה לא ייכללו, כפי שהם היו לבלבל את הניתוח. התאים מבודדים מרקמת microdissected ניתן להשתמש באופן מיידי לניתוח מולקולרי או שהם יכולים להיות מתורבת ליישומים נוספים.
כדי לסייע באופן ספציפי microdissecting EGL ולטהר נוסף NEPs, Math1-GFP (חלבון פלואורסצנטי הירוק) עכברים היו שלובות עם Nestin-CFP (חלבון פלואורסצנטי ציאן) עכברים. גורם השעתוק Math1 בא לידי הביטוי באופן ספציפי על ידי GNPs והביטוי של GFP נראה בבירור בEGL 9,13. עכברי Nestin-CFP להביע צורה גרעינית של CFP ויכולים להיות דמיינו בקלות בשכבה המולקולרית 9,14. יחד, GFP וביטוי CFP ליצור גבולות לmicrodissection של EGL (ראה איור 1). NEPs CFP החיובי בודדו לאחר מכן על ידי FACS, הבא דיסוציאציה האנזימטית של EGLs גזור.
נכון לעכשיו, השיטה הכי מנוצלת היטב לבודד תאים מEGL היא צנטריפוגה שיפוע Percoll של רקמת המוח הקטן כל 15,16. שיטה זו, עם זאת, אינה יכולה שלא לכלול לגמרי אוכלוסיות תאי Nestin + מהשכבה המולקולרית וחומר לבן ולכן לא ניתן להשתמש לחקר NEPs. microdissection ללכוד לייזר, אשר עושה שימוש בהעברת אנרגיית לייזר להסרת תאים של עניין, הוא שיטה אחרת המשמשת לבודד תאים ספציפיים בתוך רקמה הטרוגנית 17,18 אבל תאים שנתפסו יכולים לשמש רק להתאוששות של DNA, RNA וחלבון ואינם תוכל להיות מתורבת.
פרוטוקול זה מספק דרך לבודד אוכלוסייה בחיים, טהורה של NEPs מEGL במיוחד.טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לסוגי רקמות שונים שיש להם גם ארכיטקטורה אנטומיים מוכרת או תאים / אזורים שכותרתו fluorescently. לכן, היתרון הגדול של שילוב טכניקת microdissection רומן הזה לפרוטוקולי בידוד תא הוא שיכולים להיות מבודדים תאים מאזורי רקמה ספציפיים לחסל את זיהום השכן רקמה וניתן לאסוף את התאים באופן מיידי לניתוח או מתורבת עבור יישומים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת microdissection המתוארת כאן היא ההליך הראשון הצליח לבודד אוכלוסייה טהורה של תאי חיים לשימוש בניתוחים מולקולריים ופונקציונליים. כפי שהודגם על ידי Li et al. 9, NEPs מתקבל על ידי שיטה זו יכול להיות מתורבת ושולב ניסויים שונים ובגלל טוהר הגבוה שלהם, יכול לשמש גם ל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לג'יימס Oesterling לcytometry זרימת סיוע. מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן בארה"ב (R01-CA178380, ZY) ומענק אמריקאי הלאומיים מכוני דוקטורים אימון (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Riferimenti
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
