이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리
Summary
네 스틴 발현 전구 세포는 개발 소뇌의 신경 전구 세포의 새로 확인 된 집단이다. 형광 – 활성화 세포 분류와 조합하여 여기에 제시된 미세 절제 기술을 사용하여,이 세포 집단은 다른 소뇌 영역에서 오염없이 정제 될 수 있고, 추가 연구 동안 배양 될 수있다.
Abstract
미세 절제는 조직의 특정 지역을 격리하며 인접 지역에서 휴대 소스에서 오염을 제거 할 수있는 새로운 기술이다. 이 방법의 첫 번째 연구에서 이용 된 네 스틴을 발현하는 전구 세포 (네프)를, 소뇌 새싹 외부 층 (EGL) 세포의 새롭게 식별 인구. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)과 조합 미세 절제를 사용 네프의 순수한 인구 소뇌 EGL 종래 과립 뉴런 전구체로부터 다른 오염 네 스틴 발현 세포 별도로 수집 하였다. 미세 절제없이 네프의 기능성 분석은 퍼콜 구배 원심 분리 및 레이저 캡처 미세 절제으로 사용할 현재의 방법으로 불가능했을 것이다. 이 기술은 또한 인식 할 수있는 영역 또는 형광 표지 된 세포 중 하나를 포함하는 다양한 조직과 함께 사용하기 위해 적용될 수있다. 이 microdissectio 중 가장 중요한 것은, 가장 큰 장점N 기법은 절연 세포 사는 다른 한 방법으로 현재 불가능 추가적인 실험, 배양 될 수 있다는 것이다.
Introduction
소뇌 여러 세포층, 각각 별개 함유 세포 유형으로 구성된다. 분자 층 및 조롱박 층은 각각 버그만 글리와 조롱박 신경 세포를 포함하는 동안 개발 과정에서 EGL은 과립 신경 세포 전구체 (GNPs)를 증식 포함되어 있습니다. 소뇌 내 깊은 신경 줄기 세포 (NSCs의)와 희소 돌기 아교 세포 하나가 들어있는 흰색 물질을,있다.
소닉 헤지 호그 (쉬) 소뇌 발달을 조절하는데 중요한 역할을하고, 특히, 그것은 기워 수용체 PTC (), 쉬 2-4 시그널링 네거티브 레귤레이터에 결합을 통하여 GNPs의 증식을 촉진시킨다. 쉬 시그널링의 비정상적인 활성화가 모세포종 (MB), 5,6 어린이에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 생성한다.
PTC 돌연변이 MB 형질 전환 마우스 모델은 MB의 연구를위한 강력한 도구이며, 인간의 MB 7,8를 닮은 종양을 개발합니다. 사용이마우스, 그것은 GNPs 고슴도치 형 MB 7의 원래 세포 것을 발견되었다. 또한, GNPs 외에, 우리는 또한 최근에 MB를 야기 할 수있는 현상 소뇌 EGL 내의 신경 전구 세포의 집단을 고유 식별했습니다. 이러한 세포 유형 VI 중간 필라멘트 단백질, 네 스틴의 높은 수준의 발현 및 네프 9 불린다. 네프는 EGL의 깊은 부분에 위치한 유일한 신생아 소뇌 개발 과정에서 일시적으로 존재한다. 그들은 GNPs와 과립 세포 계보에 최선을 다하고 있지만,이 대기하고 MATH1, 기존의 GNPs 10 잘 설립 마커를 발현하지 않는 별개 있습니다. 또한, 네프 그들 MB의 종양에 대한 새로운 기원하게 쉬의 신호 전달 경로 (9)의 활성화 이후 MB에 상승보다 효율적으로보다 GNPs을 제공합니다.
우리는 이전에 미세 절제 기술에 의해 출생 후의 일 4 (P4)에서 소뇌 EGL에서 네프 격리여기에 9 설명했다. 조직의 직접 현미경 시각화를 통해 미세 절제는 소뇌 EGL의 특정 해부 수 있습니다. 네 스틴도 소뇌 백질과 분자 층 1,7,11,12에서 버그만 글리에 의해 NSCs을 표현하고 분석을 혼동 하듯이,이 세포를 포함하지 않는 것이 중요했다대로이 필요합니다. microdissected 조직에서 분리 한 세포는 분자 분석을 위해 즉시 이용 될 수도 있고 또 애플리케이션을 배양 할 수있다.
특히 EGL을 microdissecting을 돕기 위해 더욱 네프를 정화, MATH1-GFP (녹색 형광 단백질) 마우스는 네 스틴-CFP (시안 형광 단백질) 마우스와 함께 넘어졌다. 구체적 MATH1 GNPs 및 GFP 발현에 의해 표현되는 전사 인자는 EGL 9, 13에서 명확하게 볼 수있다. 네 스틴 – CFP 생쥐 CFP의 핵 형태를 표현하고 쉽게 9,14 분자 층으로 시각화 될 수있다. 함께, CFP 및 GFP 발현 EGL의 미세 절제를위한 경계를 생성 (도 1 참조). CFP 양성 네프는 다음 해부 EGLs의 효소 분해 다음, FACS에 의해 고립되었다.
현재 EGL에서 세포를 분리하기위한 가장 잘 이용 방법은 전체 소뇌 조직 (15, 16)의 퍼콜 구배 원심이다. 그러나,이 방법은 완전히 분자 층과 백질에서의 네 스틴 + 세포 집단을 배제 할 수 없으며, 따라서 네프의 연구에 사용될 수 없다. 관심의 세포를 제거하기 위해 레이저 에너지의 전달을 사용하여 레이저 캡처 미세 절제는 이종 조직 (17, 18)의 특정 세포를 분리하기 위해 사용되지만 캡처 세포에서만 DNA, RNA 및 단백질의 복구를 위해 사용될 수없는 수있는 또 다른 방법이다 수는 배양한다.
이 프로토콜은 특히 EGL에서 네프의 살아있는 순수한 인구를 분리하는 방법을 제공합니다.이 기술은 인식 할 수있는 해부학 적 구조 또는 형광 표지 세포 / 영역들 중 하나가 다른 조직 유형에 적용될 수있다. 따라서, 세포 격리 프로토콜에이 신규 한 미세 절제 기술을 통합의 주요한 장점은 세포 조직에 인접 오염을 제거하는 특정 조직 영역으로부터 분리 될 수 있고, 셀이 다른 애플리케이션에 대한 분석 또는 배양 즉시 수집 될 수 있다는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 미세 절제 방법은 분자와 기능적 분석에 사용하기 위해 살아있는 세포의 순수 모집단을 분리 할 제 절차이다. 리 등. 구에 의해 알 수 있듯이, 이 방법에 의해 얻어진 배양 네프 다양한 실험에 통합 때문에 고순도, 또한 마이크로 어레이 분석에 이용 될 수있다.
그것은이 미세 절제 기술에 능숙하게 시간이 걸리는 것이 매우 중요하다. 네…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 지원 유동 세포 계측법 제임스 Oesterling에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 미국 국립 암 연구소 (R01-CA178380, ZY)와 미국 국립 연구소 박사후 훈련 보조금 (5T32CA009035-37, LWY)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Riferimenti
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
