Isolasjon av distinkte cellepopulasjoner fra utviklings Cerebellum av microdissection

Summary

Nestin-uttrykke stamfedre er en nylig identifisert befolkning på nevrale stamceller i utviklingslillehjernen. Ved hjelp av microdissection teknikken presentert her i kombinasjon med fluorescerende-aktivert cellesortering, kan denne cellepopulasjon skal renses uten forurensning fra andre cerebellare regioner og kan dyrkes for videre studier.

Abstract

Microdissection er en ny teknikk som kan isolere spesifikke regioner i et vev og eliminere forurensning fra cellulære kilder i tilgrensende områder. Denne metoden ble først brukt i studiet av Nestin-uttrykke stamfedre (Neps), en nylig identifisert populasjon av celler i lillehjernen eksterne Germinal lag (EGL). Ved hjelp microdissection i kombinasjon med fluorescerende-aktivert cellesortering (FACS), er en ren populasjon av Neps samles separat fra konvensjonelle granule neuron-forløpere i EGL og fra andre kontaminerende Nestin-uttrykkende celler i lillehjernen. Uten microdissection, ville funksjonelle analyser av Neps ikke vært mulig med dagens metoder tilgjengelig, for eksempel Percoll® gradientsentrifugering og laser capture microdissection. Denne teknikken kan også bli brukt for bruk med forskjellige vev som inneholder enten gjenkjennelige regioner eller fluorescensmerket-merkede celler. Viktigst, en stor fordel med denne microdissection teknikken er at isolerte celler er levende og kan dyrkes for videre eksperimentering, som for tiden ikke er mulig med andre beskrevne fremgangsmåter.

Introduction

Den cerebellum består av flere cellelag, hver inneholdende forskjellige celletyper. Under utviklingen inneholder den EGL voksende granule nevroner forløpere (bruttonasjonalprodukt) mens den molekylære lag og Purkinje lag inneholde Bergmann gliaceller og Purkinje nevroner, henholdsvis. Dypt inne i lillehjernen ligger hvit substans, som inneholder nevrale stamceller (NSCs) og oligodendrocytter ^en.

Sonic pinnsvinet (Shh) spiller en avgjørende rolle i å regulere cerebellar utvikling og i særdeleshet, det fremmer spredning av bruttonasjonalprodukt via binding til sin reseptor Lappet (PTC), en negativ regulator av Shh signale ^2-4. Avvikende aktivering av Shh signale genererer medulloblastoma (MB), den vanligste ondartet hjernesvulst hos barn ^5,6.

PTC mutant MB transgene musemodeller er kraftige verktøy for studiet av MB og utvikle svulster ligner menneskelige MB ^7,8. Ved hjelp av dissemus, ble det oppdaget at bruttonasjonalprodukt er cellen utstedt pinnsvin-type MB ^7. Videre, i tillegg til bruttonasjonalprodukt, har vi nylig identifisert en unik populasjon av neuronale progenitorer innenfor EGL av utviklingen cerebellum som også kan gi opphav til MB. Disse cellene uttrykker høye nivåer av den type VI mellomliggende filamentprotein, Nestin, og er betegnet Neps ^9. Neps ligger innenfor den dype delen av EGL og eksisterer forbigående bare under neonatal lillehjernen utvikling. De er forpliktet til granule celle avstamning som bruttonasjonalprodukt, men er tydelig som de er passive og ikke uttrykke Math1, et veletablert markør for konvensjonelle bruttonasjonalprodukt ^10. I tillegg Neps gi opphav til MB mer effektivt enn bruttonasjonalprodukt etter aktivering av Shh signalveien ^9, noe som gjør dem en roman utstedt MB tumorigenesis.

Vi har tidligere isolert Neps fra lillehjernen EGL på postnatal dag 4 (P4) av microdissection teknikkbeskrevet her ^ni. Microdissection via direkte mikroskopisk visualisering av vev muliggjør spesifikk disseksjon av lillehjernen EGL. Dette er nødvendig som Nestin kommer også til uttrykk ved NSCs i lillehjernen hvit substans og ved Bergmann gliaceller i molekylær lag ^1,7,11,12, og det var avgjørende at disse cellene ikke inkluderes, som de ville forvirre analyse. Celler isolert fra microdissected vev kan brukes umiddelbart for molekylær analyse, eller de kan dyrkes for ytterligere anvendelser.

Til hjelp i spesielt microdissecting den EGL og for ytterligere å rense Neps ble Math1-GFP (grønt fluorescerende protein) mus krysset med Nestin-CFP (cyan fluorescerende protein) mus. Transkripsjonsfaktor Math1 er spesielt uttrykt av bruttonasjonalprodukt og GFP uttrykk er godt synlig i EGL ^9,13. Nestin-CFP mus uttrykker en kjernefysisk form for CFP og kan lett visualiseres i molekylær lag ^9,14. Sammen GFP og CFP uttrykk skaper grenser for microdissection av EGL (se figur 1). CFP-positive Neps ble deretter isolert ved hjelp av FACS etter enzymatisk dissosiasjon av de dissekerte EGLs.

Foreløpig er det mest godt utnyttet metode for å isolere celler fra EGL Percoll® gradientsentrifugering av hele lillehjernen vev ^15,16. Denne metoden er imidlertid ikke i stand til å fullstendig utelukke Nestin + cellepopulasjoner fra den molekylære sjikt og hvit substans, og kan derfor ikke benyttes for studier av Neps. Laser fangst microdissection, som bruker overføring av laserenergi for å fjerne cellene av interesse, er en annen metode til å isolere spesifikke celler i en heterogen vev ^17,18 men fangede celler kan bare brukes for utvinning av DNA, RNA og protein, og er ikke i stand til å dyrkes.

Denne protokollen gir en måte å spesifikt isolere en live, ren bestand av Neps fra EGL.Denne teknikken kan også brukes på ulike vevstyper som har enten gjenkjennelig anatomisk arkitektur eller fluorescensmerkede celler / regioner. Derfor, er den store fordelen med å innlemme denne nye teknikken i celle microdissection isoleringsmetoder som celler kan bli isolert fra bestemte vev regioner for å eliminere kontaminerende nærliggende vev og cellene kan bli samlet umiddelbart for analyse eller dyrket i andre applikasjoner.

Protocol

Bruk av dyr i denne protokollen er utført i henhold til prosedyrer godkjent av Fox Chase Cancer Center Animal Care og bruk komité. 1. Utarbeidelse av instrumenter, løsninger og Dekk Clean to sett med # 5 fine tang, ett sett av # 7 fin buet tang, ett stort kirurgisk saks, en microdissecting saks, en slikkepott og en perforert skje. Plasser instrumentene i en selvtettende sterilisering posen og autoklav. Hold instrumenter i posen til den er klar til bruk. Forbered en 3%…

Representative Results

Som vist i Figur 1A, ble cerebellare skiver fremstilt fra P4 Math1-GFP / Nestin CFP-mus, i hvilken det cerebellar EGL var dominert av GFP-uttrykkende bruttonasjonalprodukt og den molekylære sjikt ble anriket ved CFP-positive gliaceller. For å isolere Neps som er plassert i den dype del av EGL, ble skiver microdissected mellom EGL og molekylært lag (langs stiplet linje, Figur 1A). Dissekert EGLs (Figur 1b) ble deretter samlet for enzymatisk dissosias…

Discussion

Den microdissection metoden beskrevet her er den første fremgangsmåten i stand til å isolere en ren populasjon av levende celler for bruk i molekylær og funksjonelle analyser. Som vist av Li et al. ^9. Neps fremstilt ved denne metoden kan dyrkes og innarbeidet i forskjellige eksperimenter og på grunn av deres høye renhet, kan også brukes for mikromatriseanalyse.

Det er veldig viktig å ta tid til å bli dyktigere med denne microdissection teknikk. Neps be…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144