Isolering av Distinkta cellpopulationer från utvecklings Cerebellum från Microdissection

Summary

Nestin-uttryck stamceller är en nyligen identifierad population av neuronala stamceller i utvecklingslillhjärnan. Med hjälp av tekniken microdissection presenteras här i kombination med fluorescensaktiverad cellsortering, kan denna cellpopulation renas utan kontamination från andra cerebellär regioner och kan odlas för vidare studier.

Abstract

Microdissection är en ny teknik som kan isolera specifika regioner i en vävnad och eliminera föroreningar från cellulära källor i angränsande områden. Denna metod var först utnyttjas i studien av nestin-uttryck progenitorceller (NEP), en nyligen identifierad population av celler i cerebellär yttre germinal skikt (EGL). Använda microdissection i kombination med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), var en ren population av NEP samlas in separat från konventionella granulat neuron prekursorer i EGL och från andra kontaminerande nestin-uttryckande celler i lillhjärnan. Utan microdissection skulle funktionella analyser av NEP inte ha varit möjligt med nuvarande metoder som finns, till exempel Percoll gradientcentrifugering och laser capture microdissection. Denna teknik kan också användas för användning med olika vävnader som innehåller antingen igenkännbara regioner eller fluorescensmärkta celler. Viktigast, en stor fördel med detta microdissection tekniken är att isolerade celler lever och kan odlas för ytterligare experiment, som för närvarande inte är möjligt med andra beskrivna metoder.

Introduction

Lillhjärnan är sammansatt av flera cellskikt, vardera innehållande distinkta celltyper. Under utvecklingen, innehåller den EGL prolifererande granulat neuron prekursorer (BNI), medan den molekylära lagret och Purkinjetrådsanalyser skikt innehåller Bergmann glia och Purkinje nervceller, respektive. Djupt inom lillhjärnan ligger den vita substansen, som innehåller neurala stamceller (NSCs) och oligodendrocyter ^1.

Sonic hedgehog (Shh) spelar en avgörande roll i regleringen av cerebellär utveckling och i synnerhet, främjar spridningen av BNI genom att binda till sin receptor Patched (PTC), en negativ regulator av Shh signalering ^2-4. Avvikande aktivering av Shh signalering genererar medulloblastom (MB), den vanligaste elakartade hjärntumör hos barn ^5,6.

Ptc muterade MB transgena musmodeller är kraftfulla verktyg för att studera MB och utveckla tumörer som liknar människans MB ^7,8. Med hjälp av dessamöss, upptäcktes det att BNI är cellen ursprungs för hedgehog-typ MB ^7. Dessutom, förutom bruttonationalinkomst, vi har nyligen identifierat en unik population av neuronala stamceller inom EGL av framkallningslillhjärnan som också kan ge upphov till MB. Dessa celler uttrycker höga nivåer av typ VI intermediärt filamentprotein, nestin, och benämns NEP ^9. NEP finns inom den djupa delen av EGL och existerar transient bara under neonatal cerebellär utveckling. De är engagerade i granulatcell härstamning som BNI men skiljer eftersom de är vilande och uttrycker math1, en ​​väletablerad markör för konventionella BNI ^10. Dessutom NEP ge upphov till MB mer effektivt än BNI efter aktivering av Shh signalväg ^9, vilket gör dem till ett nytt ursprung för MB tumorigenes.

Vi har tidigare isolerade NEP från cerebellär EGL på postnatal dag 4 (P4) med microdissection teknikbeskrivs här ^9. Microdissection via direkt mikroskopisk visualisering av vävnaden medger specifik dissekering av cerebellär EGL. Detta är nödvändigt eftersom nestin uttrycks även av NSCs i lillhjärnan vita substansen och Bergmann glia i molekylskiktet ^1,7,11,12 och det var avgörande att dessa celler inte inkluderas, eftersom de skulle förväxla analys. Celler isolerade från microdissected vävnad kan användas omedelbart för molekylär analys eller de kan odlas för ytterligare tillämpningar.

För att underlätta specifikt microdissecting EGL och att ytterligare rena NEP, var math1-GFP (grönt fluorescerande protein) möss korsas med nestin-CFP (cyan fluorescerande protein) möss. Transkriptionsfaktorn math1 specifikt uttrycks av BNI och GFP uttryck syns tydligt i EGL ^9,13. Nestin-GFP möss uttrycker en kärnform gemensamma fiskeripolitiken och kan enkelt visualiseras i den molekylära skiktet ^9,14. Tillsammans GFP och GFP uttryck skapar gränser för microdissection av EGL (se figur 1). GFP-positiva NEP isolerades sedan genom FACS, efter enzymatisk dissociation av de dissekerade EGLS.

För närvarande är den mest utnyttjade metoden att isolera celler från EGL Percoll gradientcentrifugering av hel cerebellär vävnad ^15,16. Denna metod är dock inte helt utesluta nestin + cellpopulationer från den molekylära lagret och vit substans och kan därför inte användas för att studera NEP. Laser capture microdissection, som använder överföring av laserenergi för att avlägsna celler av intresse, är en annan metod som används för att isolera specifika celler inom en heterogen vävnad ^17,18 men infångade cellerna kan endast användas för återvinning av DNA, RNA och protein och är inte kunna odlas.

Detta protokoll är ett sätt att specifikt isolera en levande, ren population av NEP från EGL.Denna teknik kan också tillämpas på olika vävnadstyper som har antingen igenkännbar anatomisk arkitektur eller fluorescensmärkta celler / regioner. Därför är den stora fördelen med att införliva denna nya microdissection teknik i cellisoleringsprotokoll att celler kan isoleras från särskilda vävnadsområden för att eliminera kontaminerande angränsande vävnad och cellerna kan uppsamlas omedelbart för analys eller odlas för andra tillämpningar.

Protocol

Användning av djur i detta protokoll har utförts i enlighet med förfaranden som godkänts av Fox Chase Cancer Center Animal Care och användning kommittén. 1 Beredning av Instrument, lösningar och Täck Rengör två uppsättningar # 5 fin pincett, en uppsättning # 7 fina böjda pincett, en stor kirurgisk sax, en microdissecting sax, en spatel och en perforerad sked. Placera instrumenten i en självtätande sterilisering påse och autoklav. Förvara instrumenten i påsen till…

Representative Results

Såsom visas i fig 1A, har cerebellära skivor bereddes från P4 math1-GFP / nestin-GFP-möss, i vilka cerebellär EGL dominerades av GFP-uttryck BNI och den molekylära skiktet berikas av GFP-positiva gliaceller. För att isolera NEP som är belägna i den djupa delen av EGL ades skivor microdissected mellan EGL och molekylskiktet (längs den streckade linjen; Figur 1A). Dissekerades EGLS (Figur 1B) uppsamlades sedan för enzymatisk dissociation följ…

Discussion

Den microdissection metod som beskrivs här är det första förfarandet kunna isolera en ren population av levande celler för användning i molekylära och funktionella analyser. Såsom demonstreras av et al. Li ^9, NEP erhålls med denna metod kan odlas och införts i olika experiment och på grund av sin höga renhet, kan också användas för microarray analys.

Det är mycket viktigt att ta tid att bli skicklig med denna microdissection teknik. NEP…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Neurobasal media	Gibco	21103-049
PDL	Millipore	A-003-E
ultra pure low melting temperature agarose	Invitrogen	16520-050
DPBS	Gibco	14190144