A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Resistencia insecticida plantea un problema importante para los programas de control de la malaria. Los mosquitos se adaptan a una amplia gama de cambios en el entorno rápidamente, haciendo la malaria controlar un problema omnipresente en los países tropicales. La aparición de poblaciones resistentes a los insecticidas garantiza la exploración de nuevas vías objetivo de drogas y compuestos para el control del mosquito vector. Fármacos epigenéticos están bien establecidos en la investigación del cáncer, sin embargo, no se sabe mucho acerca de sus efectos sobre los insectos. Este estudio proporciona un protocolo sencillo para el examen de los efectos toxicológicos de 3-Deazaneplanocin A (DZNep), un fármaco epigenético experimental para el tratamiento del cáncer, en el vector de la malaria, Anopheles gambiae. Se observó un aumento dependiente de la concentración de la mortalidad y disminución en el tamaño en los mosquitos inmaduros expuestos a DZNep, mientras que el compuesto reduce la fecundidad de mosquitos adultos en relación con los tratamientos de control. Además, hubo una disminución dependiente de la droga en S -adenosilhomocisteına (SAH) la actividad hidrolasa en los mosquitos tras la exposición a DZNep en relación con los tratamientos de control. Estos protocolos proporcionan al investigador un procedimiento simple, paso a paso para evaluar varios puntos finales toxicológicos para una droga experimental y, a su vez, demuestran un enfoque único multi-conductor se utiliza para explorar los efectos toxicológicos de drogas o compuestos de epigenéticos solubles en agua intereses contra los mosquitos vectores y otros insectos.
La malaria es responsable del mayor número de muertes relacionadas con insectos en el mundo. Se estima que unos 219 millones de casos cada año se producen en todo el mundo, lo que resulta en aproximadamente 660.000 muertes, principalmente en África 1. A pesar de los esfuerzos concertados, programas contra la malaria se enfrentan a varios retos. Mientras que los mosquiteros tratados con insecticida y componentes clave formulario pulverización residual del programa, la resistencia a los insecticidas en poblaciones locales impiden estos esfuerzos 2. El rápido aumento de las poblaciones de mosquitos resistentes a los insecticidas se atribuye en gran medida a la capacidad de los mosquitos de la malaria para adaptarse rápidamente a los cambios en su entorno y explotar nichos diferentes 3,4,5. Para superar los actuales mecanismos de resistencia a los insecticidas, la exploración de nuevos objetivos insecticidas y compuestos de la próxima generación se justifica. Un protocolo simple, paso a paso para determinar la eficacia de los insecticidas experimentales sobre las diversas etapas de la vida de la malaria mosquitoes mejorarían significativamente estos esfuerzos.
Los estudios farmacológicos de efectos del fármaco sobre las líneas celulares y modelos animales han establecido el uso de fármacos epigenéticos como una herramienta útil para la modulación de la genética y la fisiología de las células y los organismos. Metilación del ADN y modificación de las histonas son dos mecanismos epigenéticos que afectan la expresión génica en los organismos multicelulares sin cambiar la secuencia de ADN subyacente 6. Las modificaciones post traduccionales como la metilación juegan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad celular y la expresión génica, y pueden afectar a varios procesos fundamentales 7,8,9. Investigación en algunas especies de insectos han puesto de relieve la importancia de la epigenética en procesos que implican la ovogénesis y células madre de mantenimiento 10, así como la compensación de dosis 11. Sin embargo, están todavía por explorar esos aspectos en los vectores de enfermedades. El uso de un compuesto para modular este sistema en los mosquitos puede proporcionarnos enmonumentos en las nuevas vías de destino insecticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) es un inhibidor de la metilación de la histona conocido, que impacto en diversos tipos de cánceres se han estudiado 12,13,14,15,16. DZNep es un fármaco soluble en agua estable epigenética que inhibe indirectamente la lisina de la histona metiltransferasa N (EZH2), un componente del complejo represivo polycomb 2 (PRC2) en células de mamífero. PRC2 juega un papel importante en la regulación del crecimiento de las células madre en los organismos multicelulares, y la metilación de la histona es un aspecto clave de la PRC2 mediada por silenciamiento génico. En ratones inmunodeprimidos, las células pre-tratadas con DZNep han demostrado ser menos tumorígena 17. Esta droga se está utilizado para el estudio de otras enfermedades, como la enfermedad de hígado graso no alcohólico, en el que está implicado EZH2 18. DZNep es un establecido S -adenosylhomocysteine (SAH) inhibidor hidrolasa 19, 20. La inhibición de los resultados de SAH hidrolasa en unaacumulación de SAH y, a su vez, conduce a la inhibición de la actividad metiltransferasa mediante la limitación de los grupos de donantes de metilo disponibles. SAH es un derivado de aminoácido utilizado por muchos organismos, incluyendo los insectos, en sus vías metabólicas. Un estudio reciente ha demostrado que DZNep en dosis bajas pueden afectar la diapausa y retrasar el desarrollo de insectos 21.
Aquí, un protocolo robusto para investigar los efectos de un compuesto soluble en agua en varias etapas de la vida de los mosquitos se desarrolla. Las tres partes de este protocolo incluyen instrucciones para examinar los efectos de un compuesto soluble en agua sobre los mosquitos inmaduros, adultos hembras se alimentan de sangre, y la actividad enzimática de adulto de sexo masculino y los mosquitos hembra. En primer lugar, DZNep se disuelve en agua para estudiar el desarrollo de mosquitos inmaduros y la supervivencia. Esto se realiza a dos concentraciones para comparar las diferencias que surjan de aumento de 10 veces en la exposición al fármaco. Para explorar el efecto de las drogas en adultos hembras de los mosquitos, DZNepse añade a sangre de oveja desfibrilación y alimentados artificialmente la sangre a las hembras. Posteriormente, se examina el resultado de la droga sobre la fecundidad. Finalmente, un ensayo de actividad enzimática se realiza usando 5,5'-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) como un indicador para determinar el efecto de DZNep en la inhibición de hidrolasa SAH en machos adultos y hembras de los mosquitos. Mientras que este protocolo se desarrolla con un mosquito de la malaria, Anopheles gambiae, puede ser fácilmente adaptado al estudio de los efectos de los compuestos de interés en cualquier especie de mosquito u otros insectos. Las técnicas que se detallan en este protocolo no se pueden aplicar de manera eficiente a un fármaco con poca o ninguna solubilidad en agua o medios acuosos.
Hay varios pasos vitales para la aplicación exitosa de este protocolo. Para el ensayo de las larvas, se debe tener cuidado para etiquetar y replicar cada concentración de ensayo correctamente. La aleatorización de las muestras de ensayo y la adición de la cantidad designada de fármaco a los pocillos de ensayo respectivos es una parte importante de este montaje experimental. Antes de añadir 2º larvas de mosquitos instar a una microplaca de 96 pocillos, cada larva se puede poner en una toalla de papel pa…
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |