マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ
Summary
A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Abstract
殺虫剤耐性マラリア制御プログラムの主要な問題を提起する。蚊はマラリアは熱帯諸国で遍在する問題を制御すること、すぐに環境の変化の広い範囲に適応させる。殺虫剤抵抗性の集団の出現は、媒介蚊の制御のための新規薬剤標的経路及び化合物の探索を保証します。エピジェネティック薬はよくしかし多くの昆虫への影響について知られていない、がん研究に確立されている。この研究は、マラリア媒介、 ハマダラカに、3-デアザネプラノシンA（DZNep）、癌治療のための実験的なエピジェネティック薬の毒性効果を調べるための単純なプロトコルを提供します。化合物は、治療を制御するために相対的な成体の蚊の繁殖を減少に対し、死亡率およびサイズの減少の濃度依存的増加が、DZNepに露出未熟蚊で観察された。また、S中の薬物依存的な減少があった-治療を制御するためDZNepの相対への曝露後に蚊におけるアデノシル（SAH）加水分解酵素活性。これらのプロトコルは、順番に、水溶性のエピジェネティック薬または化合物の毒性効果を探索するためのユニークな多面的なアプローチを実証し、実験的な薬剤に対して複数の毒性学的エンドポイントを評価するためのシンプルな、ステップバイステップの手順で研究者を提供し、媒介蚊や他の昆虫に対する関心。
Introduction
マラリアは世界で昆虫関連死亡の最大数を担当しています。推定2.19億例は、主にアフリカ1において約66万人が死亡、その結果、世界中で毎年起こる。協調した努力にもかかわらず、マラリアプログラムはいくつかの課題に直面しています。殺虫扱わ蚊帳とプログラムの屋内残留噴霧フォームキーコンポーネントが、地元住民の殺虫剤抵抗性は、これらの取り組み2を妨げる。殺虫剤抵抗性の蚊の個体数の急速な増加は、主に彼らの環境の変化に迅速に適応し、異なるニッチ3,4,5を悪用するマラリア蚊の能力に起因する。殺虫剤抵抗性の既存のメカニズムを克服するために、新規殺虫剤の目標と次の世代の化合物の探索が保証されています。マラリアmの様々なライフステージに実験的な殺虫剤の有効性を決定するための簡単な、ステップバイステップのプロトコルosquitoesが大幅にこれらの取り組みを強化するだろう。
細胞株および動物モデルでの薬物作用の薬理学的研究は、細胞および生物の遺伝学と生理学を調節するために有用なツールとしてのエピジェネティックな薬の使用を確立している。 DNAメチル化およびヒストン修飾は、基礎となるDNA配列6を変更することなく、多細胞生物における遺伝子発現に影響を与える2つのエピジェネティックなメカニズムである。メチル化などの翻訳後修飾は、細胞の完全性および遺伝子発現を維持する上で重要な役割を果たし、7,8,9、いくつかの基本的なプロセスに影響を与え得る。いくつかの昆虫種の研究は、卵形成を含むプロセスにおいてエピジェネティクスの重要性を強調し、細胞維持10と同様に、投与量補償11幹いる。しかし、病気のベクターにおけるそのような態様は、まだ調査されるべきである。蚊にこのシステムを調節する化合物を使用することで私たちを提供することができ新規殺虫剤のターゲット経路にスポット。 3-デアザネプラノシンA（DZNep）は、種々のタイプの癌への影響が12,13,14,15,16が研究されている既知のヒストンメチル化阻害剤である。 DZNepは間接的に、ヒストンのリジンのN -メチルトランスフェラーゼを阻害する安定な水溶性エピジェネティック薬（EZH2）、哺乳動物細胞におけるポリコーム抑制複合体2（PRC2）のコンポーネントです。 PRC2は、多細胞生物における幹細胞の増殖の調節において重要な役割を果たし、ヒストンメチル化はPRC2媒介遺伝子サイレンシングの重要な側面である。免疫不全マウスでは、DZNepで前処理した細胞は、17以下で腫瘍形成性であることが示されている。この薬剤は、EZH2が18関与する非アルコール性脂肪肝疾患などの他の疾患を研究するために使用されるようになっている。 DZNep、確立されたのS -adenosylhomocysteine（SAH）加水分解酵素阻害剤19、20である。におけるSAH加水分解酵素の阻害SAHの蓄積と、今度は、利用可能なメチル供与基を制限することにより、メチルトランスフェラーゼ活性の阻害をもたらす。 SAHは、その代謝経路において昆虫を含む多くの生物によって利用されるアミノ酸誘導体である。最近の研究では、低用量でDZNepは休眠に影響を与え、昆虫21での開発を遅らせる可能性があることを示している。
ここで、蚊の様々なライフステージ上の水溶性化合物の効果を調査するための堅牢なプロトコルが開発されている。このプロトコルの3つの部分が未熟蚊、成人の血液供給用メス、および成体雄および雌の蚊の酵素活性に対する水溶性化合物の効果を検査するための命令を含む。まず、DZNep未熟蚊の発達および生存を研究するために水に溶解する。これは、薬物曝露の10倍の増加から生じる差異を比較するためつの濃度で行われる。大人のメスの蚊に対する薬物の効果を調べるために、DZNep除細動ヒツジ血液に添加し、雌に人工的に血液が供給される。続いて、繁殖力に対する薬物の結果を検討する。最終的に、酵素活性アッセイは、成体雄および雌の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を決定する指標として、5,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を使用して実行される。このプロトコルは、マラリア蚊、 ハマダラカで開発されているが、それは容易に蚊や他の昆虫の任意の種における目的の化合物の効果を研究に適合させることができる。このプロトコルで詳述の技術は、効率的に水または水性媒体中で限られた、または全く溶解度を有する薬剤に適用されない場合があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの適用が成功に不可欠ないくつかのステップがあります。幼虫のアッセイのために、注意が正しくラベルを付け、各試験濃度を複製するために注意が必要です。試験サンプルをランダム化し、それぞれの試験ウェルに薬物の所定量を添加して設定し、この実験の重要な部分である。 96ウェルマイクロプレートに第 2齢蚊の幼虫を追加する前に、それぞれの幼虫は、過剰…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
Riferimenti
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