형광 단백질의 발현에<em> 창고 기</em> 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한
Summary
우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
개발하는 동안, 하나의 세포가 세포 분열과 이동을 모두 포함하는 매우 복잡한 공정에서 전체 유기체를 일으킨다. 나은 셀 동작의 역학의 기초 생물학적 원리를 이해하기 위해서, 발달 생물학 형광 기반 생체 이미징 기법을 사용하기 시작했다. 이러한 세포막 등 세포의 구체적인 구획, 어느 형광 염료로 처리하여 특이성 부족 및 조직 침투 (1)의 저해 방법을 표시 할 수, 또는 형광 단백질 둘을 코딩 외인성의 mRNA 배아 내로 특정 도입. 다른 기술들은 예컨대 mRNA가 같은 외인성 화합물의 효율적인 전달을 위해 사용될 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 미세 주입, 전기 천공, 미세 입자, 리포 펙션과 함께 충격 전달 3,4, 이에 한정되지 않는다. 이러한 모든 접근에 외인성 화합물을 도입하는 데 사용될 수 있지만배아를 현상 만 마이크로 인젝션은 각 셀 (3)에 소정 수량의 정확한 적용을 허용한다. 마이크로 인젝션 기술은 모든 주요 발달 모델 시스템을 위해 설명되었다 4 (예, 초파리, 선충 웜, 제브라 피쉬, 개구리, 마우스)뿐만 아니라 발전기구의 발전을 이해 목표 비교 연구에 사용되는 등 일부 다른 모형 (4)에 관해서 (예를 들어, 말미잘, 환형 동물 벌레, 성게, 멍게의 tunicates, 두삭 동물의 amphioxus).
함께 tunicates과 척색 문을 설정 척추 동물로, 특히 적합 모델입니다 Cephalochordates는 척색 동물의 진화와 무척추 동물의 조상 5-8에서 척추 동물의 다양 화를 연구한다. 두삭 동물의 혈통은 초기 척색 진화하는 동안 분기; 세 장군으로 세분화되어 현존하는 cephalochordates (밀기울chiostoma, Asymmetron 및 Epigonichthys가), 척추 동물과 유사 모두 전체 해부학과 게놈 구조 5-8의 관점에서. 지금까지 설명 된 cephalochordates의 약 30 종, 다섯 배아 발달 연구 6,9 사용할 수 있습니다 Asymmetron의 lucayanum (바하마 창고 기), Branchiostoma floridae (플로리다 amphioxus), 창고 기 (유럽 amphioxus) Branchiostoma belcheri (중국 amphioxus)과 Branchiostoma japonicum (일본 amphioxus). 이 종의 세 가지의 잘 익은 성인 (B.의 lanceolatum, B.의 belcheri 및 B. japonicum)는 주문형 짝짓기의 계절 (10, 11) 중 산란을 유도 할 수있다. 또한, 적어도 용 B. lanceolatum, 효율적인 산란은 이에 연구소 용에 대한이 특정 두삭 동물 종에 액세스 할 수 있도록, 인공 해수 (12)에 유도 할 수있다천연 해수에 액세스 할 수 없습니다 이거 야. B의 조합, lanceolatum, 이러한 미세 주입 등의 효율적인 전달 방법과 배아에 편리하고 안정적으로 액세스의, 지금까지 13 ~ 15, (B. floridae와 B belcheri 모두) amphioxus에서 개발 된 유일한 전달 기술의 개발을 가능하게합니다 계보 tracing- 및 동적 셀 동작 기반 접근 방식을 포함 속임수 기술의 새로운 제품군.
의 mRNA를 효율적으로 미세 주입을위한 프로토콜은 B의 형광 단백질을 표현 lanceolatum 배아, 따라서 개발되었다. 또한, B의 라이브 영상을위한 기본 툴킷을 제공하는 lanceolatum 배아, 벡터 시스템은 막 – 관련 단백질의 형광 핵 발현 허용하는 것이 개발되었다. 막 타겟팅의 경우, 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는)는 mCherry 및 eGFP는 인간 HRAS의 CAAX 상자와 핵 현지화했다 융합했다제브라 피쉬 히스톤 2B (H2B) 엑손 (그림 1, 보충 파일 1)을 융합하여 얻을 수 있습니다. 또한, 단백질 번역을 최적화 할 목적으로, 구조체의 서열과 코작 코돈 변형 된 사용 및 B.에 적응 lanceolatum. 종합적으로, 여기에 제시된 주입 방법 및 발현 벡터는 특히 최근의 생체 영상 기술에 기반하여 형광 분석 cephalochordates 새로운 실험 접근법의 생성을위한 기초로서 역할을한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 글에서, B.의 주입을 위해, 처음으로, 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제시 lanceolatum 난자, 이는 후 B. floridae 13, 14 및 B belcheri 15는, 이와 같은 기술이 기재되어있는 제 amphioxus 종이다. 중요한 프로토콜은 B. 형광 단백질의 생산에 적합한 벡터 시스템의 설명을 포함 여기에 설명 시험 관내 생산 된 mRNA의 주입으로부터 lanceolatum (후술…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 축산은 "Animalerie 센트 드 지프 쉬르 이베트"에 의해 지원을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) FP6 부여 "Embryomics"에 의해 ANR 부여 "에 의해, 마이클 슈베르트에 ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 및 ANR-11-JSV2-002-01)에서 기금에 의해 지원되었다 ANR- 장 – 프랑수아 니콜라스와 나딘 Peyriéras에 10 BLAN-121801 데브 – 프로세스 ". 주앙 엠마누엘 카르발류는 FCT 박사 교제에 의해 자금을 조달 (SFRH / BD / 2,012분의 86,878).
여기에 설명 된 벡터에 대한 요청은 저자에게 직접 해결할 수 있습니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
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