Skjelettmuskulatur er viktig for locomotion og er likene 'viktigste protein butikken. Muskelhygieniske målinger innenfor C. elegans er beskrevet. Potensielle endringer i muskelstruktur og funksjon er vurdert ved hjelp lokalisert GFP og kationiske fargestoffer.
Muskel er et dynamisk vev som reagerer på endringer i ernæring, mosjon, og sykdomstilstanden. Tap av muskelmasse og funksjon med sykdom og alder er viktige folkehelse byrder. Vi har for tiden forstår lite om genetisk regulering av muskel helse med sykdom eller alder. Den nematode C. elegans er en etablert modell for forståelse av den genomiske regulering av biologiske prosesser av interesse. Denne ormen kropp veggen muskler vise en stor grad av homologi med musklene i høyere metazo arter. Siden C. elegans er en transparent organisme, tillater lokalisering av GFP til mitokondrier og sarcomeres visualisering av disse strukturene in vivo. På samme måte, foring av dyr kationiske fargestoffer, som akkumuleres basert på eksistensen av en mitokondriell membranpotensialet, kan vurderingen av mitokondriell funksjon in vivo. Disse metodene, samt vurdering av muskelprotein homeostasis, er kombinert med vurdering av hele dyremuskelfunksjon, i form av bevegelses assays, for å tillate at korrelasjon av sub-cellulære defekter med funksjonelle målinger av muskelyteevne. Dermed gir C. elegans en kraftig plattform som å vurdere effekten av mutasjoner, genet knockdown, og / eller kjemiske forbindelser på muskelstruktur og funksjon. Til slutt, som GFP, kationiske fargestoffer, og bevegelses assays blir vurdert ikke-invasiv måte, kan prospektive studier av muskelstruktur og funksjon bli utført på tvers av hele livsløpet, og dette i det foreliggende, kan ikke lett undersøkt in vivo i en hvilken som helst annen organisme.
Muscle er en multifunksjonell vev, godt verdsatt for sin rolle i bevegelse, postural støtte og metabolisme. Utvikling og vedlikehold av sunn muskel krever koordinering av flere cellulære prosesser og komponenter. Enten gjennom skade eller sykdom, kan det oppstå feilregulering, noe som resulterer i endrede muskelstruktur og / eller funksjon. Age-forbundet nedgang i muskelfunksjon presenterer en betydelig belastning for helsebudsjettene i den vestlige verden, siden muskelmasse 1,2 og spesielt muskelstyrke og utholdenhet 3-5 er negativt korrelert med dødelighet. Målingen av forhold knyttet til forverret muskelfunksjon som for eksempel endret mitokondriefunksjon eller sarcomere avbrudd, kan gi større forståelse av mekanismene som ligger til grunn generelle muskel utvikling og helse.
C aenorhabditis elegans (C. elegans) er en mikroskopisk nematode best kjent fordi det var den første flercellede organismen til å ha hele sin genom sekvensert 6, den første som har gener forstummet hjelp RNAi 7, og den eneste metazoan å ha sine hele cellen avstamning 8 og nevroanatomi 9 bestemt. C. elegans ble først foreslått som en modell for studiet av den genetiske kontroll av atferd i 1974 av Sydney Brenner 10 og viktigheten av dette og etterfølgende arbeid ble anerkjent med den første av tre Nobelpriser tildelt C. elegans forskere. Omtrent 35% av C. elegans gener er identifisert orthologues hos mennesker, med C. elegans å være en nøkkel organisme som brukes til å forstå den genetiske styring av 11 muskelutvikling. Nesten hver genet i C. elegans genom kan bli slått ned gjennom RNAi 7,12. Således, ved å banke ned gener i fullt utviklet muskler, genetiske komponenter som bidrar til regulation av muskel helse kan bli undersøkt med relativ enkelhet 13.
Den kombinerte evne til å bruke RNAi, mutanter, og kjemiske forbindelser gjør C. elegans en ledende system for utforsking av genetisk regulering 7,14,15 av muskelstruktur og funksjon med alderen 16 og i sykdomsmodeller 17. Virkningen av genet knockdown, mutasjon, og / eller eksponering for kjemiske forbindelser ved muskelstruktur og / eller funksjon kan måles gjennom flere aspekter. Her beskriver vi kort enkle teknikker for å vurdere C. elegans muskelstruktur og funksjon, og mange av disse kan brukes i prospektive studier av muskel helse.
Utvikling av grønn fluorescerende protein (GFP) 18 har aktivert visualisering av både lokaliteten av spesifikke proteiner og den generelle strukturen av organeller i C. elegans. Her forklarer vi hvordan GFP uttrykk spesispesielt er innenfor kroppsveggen muskel mitokondrier, kan kjernene, eller sarcomeres bli brukt for å bestemme om dystrofi av disse sub-cellulære strukturer er til stede. Som struktur er ikke alltid en pålitelig surrogat for funksjon, vi også forklare hvordan bruk av kationiske fargestoffer in vivo tillater vurdering av nedsatt mitokondriemembranpotensialet innen muskel. Når de fargestoffer som anvendes i kombinasjon med GFP, tillater de studiet av arkitekturen og funksjon i en tidsmessig måte i hele levetiden. Til slutt, vi forklarer også hvordan proteinet homeostase i muskelen kan vurderes, og hvor alle disse tiltak kan brukes til å korrelere endringer i hele animalsk muskel tilstand ved bruk av bevegelses assays. Disse teknikkene kombinert med genet knockdown, mutasjoner og / eller kjemiske forbindelser tilveiebringe en kraftig arsenal for å studere hvordan spesifikke gener eller forbindelser som påvirker helsen muskel in vivo. Parallellene i struktur, metabolisme og brutto funksjon av muskler mellom C. elegans ogpattedyr mener C. elegans er en enestående modellorganisme for å forstå regulering av muskel i høyere organismer, inkludert mennesker.
Disse fremgangsmåter tillater utforskning av muskel fra den macrophysiology av bevegelsen for å identifisere subcellulære defekter som er tilstrekkelig til å forårsake en bevegelse defekt. Når det kombineres disse metodene tillater detaljert analyse av muskel. Den innsikten gjør at ytterligere testing av muskelorienterte hypoteser som gjelder for generell fysiologi, patofysiologi og aldring.
Movement Analyser
En bevegelse feilen viser en forstyrrelse av normal nevromuskulær funksjon. Dette kan være spesifikke for nerver eller muskel, eller det kan være vanlig mellom flere vev. De vanskeligste stadiene av fullbevegelsesanalyser velger ormer som er representative for befolkningen og / eller behandling, og også sørge for at eksperimentator ikke skade dyret ved overføring til M9. Det er viktig å ha et stort prøvestørrelse for å oppnå en representativ og nøyaktig vurdering av bevegelse. Når analysering svært pennetrant virkninger, for eksempel som ofte sett i mutanter, en prøvestørrelse på ti dyr hver vurderes for bevegelse ti ganger er tilstrekkelig til å finne et statistisk signifikante forskjeller versus villtype. Imidlertid enkelhet av bevegelses assays og letthet av dyrknings C. elegans bety at hundrevis av ormer kan raskt bli vurdert for å sikre kvantitativt robuste resultater. Når analysere effektene som vises til stede i bare en del av en befolkning er det viktig å finne ut hvor stor andel av befolkningen ser ut til å bli påvirket, samt alvorlighetsgraden av feil i de mest berørte dyrene. I slike situasjoner kan et større antall dyr, bør vurderes for å tilveiebringe data for den minimale andel av befolkningen påvirkes. Ofte både narkotika og RNAi behandlinger vil produsere alvorlige bevegelsesfeil i en liten andel av befolkningen. I noen tilfeller øke dosen av behandlingen eller fremgangsmåten, og for levering vil øke andelen av affected dyr og løpedoseresponskurver kan være nyttig for å bestemme den optimale konsentrasjonen av et medikament eller RNAi. En andre begrensning av denne bevegelsen er at analysen ormer er manipulert for å vurdere bevegelse. Således er både ormer stimulert og underkastes en viss grad av osmotisk stress når plukket inn i væsken. Graden av osmotisk stress kan begrenses ved hjelp av M9 eller BU buffer 19 i motsetning til vann. Noen av disse begrensningene er lindres ved å måle vanlig bevegelse på plater ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sporingssystemer 34 eller gratis plug ins for ImageJ 35. Måle bevegelsen rate av et dyr kan gi viktig informasjon om generelle muskel helse, herunder endringer i funksjon som kan måles gjennom hele levetiden, og den ikke-invasivitet av denne metoden er nøkkelen for potensielle livslang studier av muskelfunksjon.
Avbildning av den kontraktile Apparat
<p class = "jove_content"> Ormen belastning brukes her til bilde kontraktile apparat strukturen var PJ727 36 som uttrykker en myosin GFP fusjonsprotein som er lokalisert til sarcomeres innenfor kroppen veggen muskler. Bruk av denne belastningen muliggjør visualisering av sarcomere strukturen i levende dyr. I likhet med bevegelsen analysen beskrevet ovenfor, kan en viktig fordel med å bruke GFP-merket sarcomeres å vurdere sarcomere strukturen er at fremgangsmåten er relativt ikke-invasiv og derfor kan brukes til å prospektivt følge sarcomere strukturen i de enkelte dyr gjennom hele levetiden. Den største vanskeligheten med denne metoden er at ormer som blir fotografert er fortsatt i live og derfor i bevegelse, noe som gjør det vanskelig å få godt fokuserte bilder. Flere metoder kan benyttes for å redusere bevegelse og gjøre bildebehandling enklere; disse inkluderer bedøvelse eller lammende ormer og immobilisering via trykk, sug, eller bruk av en høy viskositet løsning. Hver av disse metodene for immobiliserteasjon har den ulempe at det kan forandre seg neuromuskulær funksjon. Derfor er det essensielt å inkludere egnede ubehandlede kontroller i analyser. Det kan også være aktuelt å benytte minst to uavhengige metoder for immobilisering for å bekrefte resultatene ikke skyldes problemer med det immobiliserende metode, avhengig av hvor mye brukt metode for immobilisering er valgt for spørsmålet under studien. Her har vi brukt enkle press fra dekkglass på ormen å indusere redusert bevegelighet. Etter å ha plassert dekkglass, vil væsken under dekk fordampe og dekkglass vil dermed begynne å produsere mer press på de ormer, typisk dette tar 2-5 minutter å produsere nok redusert bevegelse for å aktivere enkel bildebehandling.Det er viktig å overvåke ormer tett etter at dekkglass er blitt innført som trykket vil etter hvert øke nok til å forårsake ormer å briste fra for høyt trykk, typisk 10-15 min etter koverslip tillegg. Ytterligere buffer kan bli innført ved hjelp av en pipettespiss rundt kantene av dekkglass for å unngå klemskade til ormer. Neglelakk kan brukes til å forsegle kantene av dekkglass og hindre fordampning, selv om dette hindrer uttak av dyrene fra under dekkglass, hvis ønskelig. Likeledes kan bruken av silikonperler i oppløsningen bidra til å redusere mengden av trykkdekkglass på de steder ormer.
Akkurat som med å vurdere for en bevegelse defekt, er det viktig å vurdere pene effekt. Pene kan vurderes høyt hvis 80-100% dyr viser en fenotype på NGM plate, delvis hvis 21-79% og lav hvis ≤20% av skjermbildet befolkningen en innvirkning. For svært penetrant effekter, kan mindre utvalgsstørrelser brukes til å produsere betydelige kvantitative data om sarcomere defekter. I tilfeller hvor effekten har en lav penetrans, utvalg av dyr som viser en klar bevegelse defekt i respons til medikamenteller RNAi behandling kan være nyttig i å analysere sarcomere defekter hos dyr er mest berørt av behandlingen. Det er imidlertid ikke nødvendigvis tilfelle at omfanget av behandlingseffekt på bevegelse og subcellulære struktur er den samme. Således kan det være ønskelig å undersøke omfanget av defekter som er tilstede i en stor populasjon, for eksempel 100 dyr. Dette gjør det mulig for forståelsen av fordelingen av defekter gjennom en populasjon. Det kan også være ønskelig å undersøke omfanget av defekter i de mest alvorlig angrepne dyr og / eller undersøke sammenhengen mellom utstrekningen av sarcomere defekt og utstrekningen av bevegelsen defekt. Potensielle problemer til side, er denne metoden raskere og enklere enn andre metoder for å vurdere sarcomere struktur. Dette hastighet og brukervennlighet er imidlertid underlagt en viktig begrensning, sarcomeres inneholder GFP fusjonsproteiner er ikke helt normal 37 og derfor vurdering av forstyrret sarcomeres bør bekreftes ved hjelp av ytterligere flere arbeidsintensive metoder.Disse fremgangsmåter omfatter bruk av polarisert lys 38, phalloidin beising 39, 40 og indirekte immunfluorescens. Av disse metoder, er bare polarisert lys relativt ikke-invasive; de andre metodene krever fiksering og kan derfor ikke brukes i prospektive studier av de enkelte dyr, heller de bare kan brukes for å bekrefte, krysser seksjonsvis, resultater fra slike studier.
Avbildning av Mitokondrielle Networks
Ormen stammen benyttes for de mitokondrielle avbildnings eksperimenter var CB5600 7 som uttrykker GFP et fusjonsprotein lokalisert til mitokondriene og et GFP β-galaktosidase-fusjonsprotein lokalisert til kjernen, både i kroppen veggen muskler. Som med bruk av PJ727 for bildebehandling sarcomeres, bruk av denne belastningen muliggjør visualisering av mitokondriell nettverksstruktur i levende dyr. Således kan denne stamme brukes til å vurdere dynamiske endringer som oppstår, for eksempel redusert mitochondrial fusjon og / eller økt mitokondriell fisjon 41. Også som for bildebehandling sarcomeres, den største vanskeligheten med denne metoden er at ormene blir fotografert er fortsatt i live og i bevegelse, noe som gjør det vanskelig å få godt fokuserte bilder. Selv om flere fremgangsmåter, som diskutert i større detalj ovenfor, kan anvendes for å redusere bevegelse, mitokondrier vises spesielt følsomme for intervensjoner som induserer redusert bevegelse. For eksempel mest brukte anestesi målet komponenter av mitokondrie respiratoriske kjeden og er derfor må brukes med forsiktighet i studier av normal mitokondrie struktur og funksjon. Likeledes må de fleste lammelse midlene brukes med forsiktighet i studier av normal mitokondrie struktur og funksjon, som de fleste lammelse midler føre til mindre signal å passere gjennom nevromuskulære krysset og funksjonell denervering av muskelen er tilstrekkelig til å indusere mitokondrie fragmentering. Forsøkene i denne studien benyttet press for å immobilisere dyrs men andre har med hell brukt levamisole 42, selv om det er viktig å avbilde dyr umiddelbart.
Til slutt, ulike bakterielle forurensninger i kulturer, for eksempel B. subtilis, kan indusere mitokondrie fragmentering; Derfor er det viktig å inkludere egnede ubehandlede kontroller i analyser. For svært penetrant effekter, kan mindre utvalgsstørrelser brukes til å produsere betydelige kvantitative data om mitokondrielle nettverksfeil. Imidlertid, på grunn av utbredelsen av mindre defekter i mitokondrie nettverk, er dette lite antall dyr sannsynlig å være dobbelt så mange som trengs for vurdering av sarcomere struktur. I tilfeller hvor effekten har en lav penetrans, kan utvalg av dyr tydelig viser en bevegelse defekt respons på narkotika eller RNAi behandling være nyttig i analysering av mitokondrie defekter i dyr er mest berørt av behandlingen. Imidlertid, som nevnt ovenfor, er det ikke nødvendigvis slik at denGraden av behandlingseffekt på bevegelse og subcellulære struktur er den samme. Således kan det være ønskelig å undersøke omfanget av defekter som er tilstede i en stor populasjon, for eksempel 150 til 200 dyr, så vel som den grad av forstyrrelse i de mest alvorlig angrepne dyr og nærvær eller fravær av graden av forstyrrelse med utstrekning bevegelse defekt. Andre stammer med fluorescensmerket mitokondriene kan brukes for å bekrefte resultatene oppnådd i CB5600, kan imidlertid bruken av forskjellige fluorescerende proteiner påvirke grunnlinjen nettverk av mitokondrier. For eksempel vises bruken av en tomm RFP-20-fusjonsprotein for å visualisere mitokondrier å bevirke øket baseline mitokondriell fragmentering versus bruk av mitochondrially lokaliserte GFP 17. Mens andre metoder som immunfluorescens og elektronmikroskopi kan anvendes for å vurdere mitokondriell struktur, har de ikke tillater in vivo vurdering av mitokondrielle dynamikk fordi en fikseringstrinn er kreved. Andre metoder slik som bruk av mitochondrially lokaliserte fargestoffer kan anvendes uten fiksering og kan derfor også brukes i stedet for bruk av mitochondrially lokalisert GFP. Som omtalt i neste avsnitt, anvendelsen av slike fargestoffer som også tillater råolje vurdering av in vivo-mitokondriell funksjon.
Vurdere mitokondriemembranen Potential in vivo i C. elegans
En rekke farvestoffer er tilgjengelige for merking 28 mitokondrier. Disse fargestoffer gir en alternativ metode for å visualisere mitokondrienettverksstruktur i levende C. elegans. Mange av disse fargestoffer også tillate urene vurdering av mitokondriell funksjon in vivo, fordi de hoper seg opp i mitokondriene basert på den mitokondriemembranpotensialet. Her har vi brukt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, som inntas gjennomfordøyelseskanalen, med noen tillegg inn i ormen via skjellaget på grunn av permeabilization gis ved å bli oppløst i 0,5% DMSO. Etter inntreden i cellen C 32 H 32 Cl 2-N 2 O blir oksydert og sekvestrert av mitokondriene, hvor det binder svovelholdige aminosyrer (f.eks metionin og cystein). Dannelsen av disse fargestoff-peptid-komplekser betyr C 32 H 32 Cl 2-N 2 O forblir i mitokondriene når merket 28. En viktig vanskelighet med bruken av mitokondrielle fargestoffer er at de vil merke alle mitokondrier i dyret. Derfor har vi utført merking i CB5600, den samme stamme som er beskrevet ovenfor for å vurdere muskel mitokondriell nettverksstruktur. Ved å bruke en rød mitokondrie fargestoff, en stamme av ormer som uttrykker GFP i muskel mitokondrier, og en trippel pass filter, er det relativt enkelt å avbilde bare mitokondrier i muskel ved å finne mitokondrier som er ospekter av colocalization av rødt fargestoff og GFP merkede mitokondrier. Den vanskeligste skrittet i å utføre denne colocalization tilnærmingen er bildebehandling fordi fargestoffet er foto-bleket i løpet av sekunder under høyt intensitet fluorescerende lys. Denne effekten kan være begrenset ved å holde fluorescens på lav effekt inntil eksperimentator er klar til bilde og deretter justere fluorescens intensitet tilsvarende. Når man har erfaring med bruk av fargestoffer annen tilnærming er å anvende konfokal mikroskopi med Z-stabler til bilde bare mitokondrier i riktig vev; mitokondrie nettverk i muskelen er ganske tydelig i forhold til andre vev. Uheldigvis betyr den manglende evnen C 32 H 32 Cl 2-N 2O til å forlate mitokondrier 28 som, i motsetning til sarcomere og mitokondrielle bildedannende teknikker nevnt ovenfor, kan den ikke brukes til å prospektivt følge tap av mitokondriefunksjon med tiden, med mindre C 32 H 32 Cl 2 N 2 Otilsettes ved diskrete tidspunkter for å separere dyrebestander. Denne begrensning kan overvinnes ved hjelp av fargestoffer som JC-10 som gjør forlater mitokondrier ved sammenbrudd av membranpotensialet 43. Mitokondrier kan også bli isolert fra C. elegans 30 for påfølgende biokjemiske analyser. Slike uttrekk tillater kvantifisering av mitokondriemembranpotensialet ved å kvantifisere graden av lipofile kationiske fargestoffet opptak ved hjelp av flowcytometri eller en fluorescerende plateleser 44. Etter å ha etablert en svekket mitokondriemembranpotensialet, er det også mulig å fastslå om tap av proton-gradient oversettes til et tap av ATP-produksjon ved hjelp av en følsom bioluminometric luciferase-basert metode 45.
Vurdering av protein degradering i C. elegans
Ormen stamme anvendes her for å vurdere muskelproteindegradering ble PD55, som inneholder en bestemt muskel β-galaktosidase som kontinuerlig syntetisert gjennom hele utviklingen til voksen alder er nådd, og som forblir stabil i cytosol for neste 72-96 hr 19. Således måling av β-galaktosidase-nivåer under utvikling overveiende indikerer virkningen av intervensjoner på syntese fra myosin-promotoren, mens tapet av β-galaktosidase i voksen alder indikerer en intervensjon har utløst øket cytosolisk protein degradering 19. Nøkkelen skritt i å vurdere β-galaktosidase aktiviteten er å sikre effektiv uttørking. Unnlatelse av å effektivt desiccate dyrene resulterer i dårlig bestemmelse av X-gal-substratet, og derfor dårlig blå farge i kroppen-veggen muskler av dyrene. For å sikre god uttørking forseglingen på eksikkator bør sjekkes og prøven bør sjekkes på 5-10 min intervaller i hele uttørking å vurdere fremgangen (dvs. 20 mL prøve burde ha tørket innen 10 min og de resterende 20 miner å sikre en helhetlig uttørking). Den β-galaktosidase-assay er et aktivitetsanalyse derfor en hensiktsmessig kontroll er viktig. I tillegg, redusert farging av voksne i en behandlingstilstand i forhold til å kontrollere beviser ikke at nedbrytningen skjer; heller det angir nedsatt enzymatisk aktivitet i respons til behandlingen. For å bekrefte degradering, må mer arbeidskrevende western blot analyse være ferdig mot β-galaktosidase 13 og dette gjør at kvantifisering protein nedbrytning i små populasjoner av telte ormer. Western blot bandet tettheter kan kvantifiseres ved hjelp ImageJ 46. En annen begrensning ved denne metode er at bruken av transgene proteiner ikke informerer om fysiologiske mål for nedbrytning og om slike svar proteomic og / eller målrettede hypotese drevet Western blots som anvendes må være 13. Til slutt, som syntesen av den transgene proteinet som anvendes i disse undersøkelser slås av i tidlig voksen alder 19 </sup>, må andre metoder brukes når som ønsker å undersøke forandringer i muskelproteinsyntese i fullt utviklet C. elegans muskel; for eksempel, stabile eller radioaktive isotopen metoder.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |