भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से कार्डिएक पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की व्युत्पत्ति
Summary
In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Abstract
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
Introduction
दिल की बीमारी दुनिया में प्रमुख कारण आज रहता है और मृत्यु दर में पिछले दो दशकों (अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन) में लगभग अपरिवर्तित बनी हुई है। प्रभावी ढंग से रोकने के लिए या दिल की विफलता को उल्टा करने के उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। एक आशाजनक रणनीति स्टेम कोशिका जीव विज्ञान एक के तेजी से विकास के बाद सेल आधारित चिकित्सा है। इस संबंध में, multipotent सीपीसी के कारण पैदा करना है, लेकिन केवल हृदय वंश भेदभाव करने के लिए प्रतिबद्ध करने के लिए अपनी क्षमता को उपचार के लिए एक उत्कृष्ट सेल स्रोत हो सकता है। इसलिए, कुशल और मजबूत विधि पैदा करते हैं और दिल सेल थेरेपी के अध्ययन के लिए बहुत महत्व का है सीपीसी अलग करने के लिए।
इस प्रोटोकॉल जल्दी embryogenesis और कैसे ESCs से उनकी पीढ़ी के दौरान पहचान भ्रूण सीपीसी पर केंद्रित है। विभिन्न सीपीसी भी हड्डी marrows 2 से, भ्रूण और वयस्क दिल से पृथक किया गया है। भ्रूण विकास के दौरान, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMPs), पंखहीन प्रकार MMTV एकीकरण साइट परिवार के सदस्यों (Wnts) और नोडल संकेतों Mesp1 + multipotent मेसोडर्म 3 की प्रतिबद्धता प्रेरित। Mesp1 + कोशिकाओं तो भ्रूण सीपीसी 4 में अंतर। ये सीपीसी आम तौर पर NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), आइएसएल लिम homeobox 1 (Isl1), टी बॉक्स 5 (Tbx5), और myocyte बढ़ाने कारक -2 सी (Mef2c), प्राथमिक और दूसरा दिल क्षेत्रों फार्म, HCN4 द्वारा चिह्नित है, और कर रहे हैं कार्डियोजेनेसिस 5-10 दौरान दिल के प्रमुख भागों में योगदान। Nkx2-5 + और Isl1 / + Mef2c + दोनों सीपीसी cardiomyocytes में अंतर करने में सक्षम हैं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी), और endothelial कोशिकाओं 5-8। इस प्रकार इन सीपीसी हृदय वाहिका संरचना के साथ ही हृदय के ऊतकों को जन्म देने के लिए और सेल आधारित हृदय चिकित्सा के लिए एक आदर्श सेल स्रोत हैं जाएगा। नतीजतन, इन विट्रो में सीपीसी पैदा करने के हृदय अध्ययन में एक प्रमुख अनुसंधान ध्यान केंद्रित किया गया है। ESCs असीमित विस्तार क्षमता एक के बादएन डी ब्लास्टोसिस्ट चरण में आईसीएम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्राकृतिक embryogenesis निम्नलिखित भ्रूण सीपीसी में ESCs के भेदभाव सीपीसी प्राप्त करने के लिए एक तार्किक और प्रभावी तरीका माना जाता है।
ESCs से सीपीसी प्राप्त करने के लिए एक व्यापक रूप से व्यावहारिक दृष्टिकोण के ईबीएस 11 में ESCs को जोड़ता है। भेदभाव दक्षता में सुधार करने के लिए, हृदय के विकास के ज्ञान के आधार पर परिभाषित रासायनिक और वृद्धि कारकों 12-14 इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, व्यापक रूप से क्षेत्र में स्वीकार कर रहे हैं, जो कोई निश्चित सीपीसी मार्करों, विशेष रूप से कोई सेल सतह मार्करों, वहाँ रहे हैं। इस मुद्दे के समाधान के लिए, ESCs Isl1 + या Mef2c + सीपीसी और रचनात्मक / loxP प्रणाली का उपयोग फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ उनके डेरिवेटिव चिह्नित करने के लिए इंजीनियर हैं। Cre recombinase Isl1 / Mef2c प्रमोटर / बढ़ाने के नियंत्रण के अधीन में दस्तक दी है। एक विधान प्रमोटर द्वारा संचालित संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन आरएफपी या YFP जीन Cre recombinase साथ flox स्टॉप कोडोन के छांटना द्वारा सक्रिय किया जा सकता है(ISL1: रचनात्मक;-pCAG-flox बंद flox GFP या आरएफपी / Isl1-रचनात्मक; Rosa26YFP / Mef2c-रचनात्मक; Rosa26YFP) 5,6। ESCs दूसरा दिल क्षेत्र सीपीसी में भेदभाव कर रहे हैं एक बार, Isl1 / Mef2c प्रमोटर / बढ़ाने संचालित रचनात्मक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं को सक्रिय करेंगे और सीपीसी FACS-शुद्धि से समृद्ध किया जा सकता है। संक्षेप में, ईबी एकत्रीकरण विधि ईएससी भेदभाव आरंभ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। भेदभाव दक्षता बढ़ाने के लिए, विभेदित कोशिकाओं एस्कॉर्बिक एसिड (एए) और ऐसे BMP4, Activin एक और VEGF 13,15 के रूप में वृद्धि कारकों के साथ व्यवहार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल माउस और मानव ESCs दोनों का उपयोग कर मजबूत और कुशल सीपीसी भेदभाव की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
| Knockout SR | Life technology | 10828028 |
| Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
| DMEM | Life technology | 11965118 |
| NEAA | Life technology | 11140050 |
| GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
| N2 | Life technology | 17502048 |
| B27 | Life technology | 12587010 |
| Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
| IMDM | Life technology | 12440061 |
| Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
| Pyruvate | Life technology | 11360070 |
| Dispase | Life technology | 17105041 |
| Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
| DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
| BSA | Life technology | 15260037 |
| Trypsin | Life technology | 25200056 |
| Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
| 1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
| VEGF | R&D | 293-VE |
| Bmp4 | R&D | 314-BP |
| ActivinA | R&D | 338-AC |
| bFgf | R&D | 233-FB |
| Fgf10 | R&D | 345-FG |
| mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
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