Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller
Summary
In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.
Abstract
Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.
Introduction
Hjärtsjukdom är fortfarande den ledande orsaken i världen idag och dödstalen har förblivit i stort sett oförändrade under de senaste två decennierna (American Heart Association). Det finns ett kritiskt behov av att utveckla nya terapeutiska strategier för att effektivt förhindra eller vända hjärtsvikt. En lovande strategi är cellbaserad terapi efter den snabba utvecklingen av stamcellsbiologi 1. I detta hänseende skulle multipotenta CPC vara en utmärkt cellkälla för terapi på grund av deras förmåga att proliferera men beslutats endast till hjärt härstamning differentiering. Därför, för att effektivt och robust metod generera och isolera CPC är av stor betydelse för hjärtcellterapistudier.
Detta protokoll är inriktat på embryonala CPC identifierats under tidig embryogenes och hur deras generation från ekonomiska och sociala råd. Olika CPC har isolerats från embryonala och vuxna hjärtan, även från benmärg 2. Under embryoutveckling, ben morphogetiska proteiner (BMP), vinglös typ medlemmar MMTV integrations sajt familj (Wnts) och knutpunkter signaler inducerar åtagande Mesp1 + multi mesoderm 3. Mesp1 + celler differentierar sedan in i de embryonala CPC 4. Dessa CPC vanligtvis präglas av HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), och myocyt förstärkare faktor 2C (Mef2c), bildar primära och andra hjärtfält, och bidra till stora delar av hjärtat under kardiogenes 5-10. Både Nkx2-5 + och Isl1 + / Mef2c + CPC har möjlighet att differentiera till kardiomyocyter, glatta muskelceller (SMC), och endotelceller 5-8. Således dessa CPC kommer att ge upphov till hjärtkärl samt hjärtvävnad och är en idealisk cellkälla för cellbaserad hjärtbehandling. Följaktligen genererar CPC in vitro har varit en viktig forskningsfokus i kardiovaskulära studier. Eftersom ekonomiska och sociala råd har obegränsad kapacitetsutbyggnad and representera ICM cellerna i blastocyststadiet, är differentiering av ekonomiska och sociala råd i embryonala CPC efter den naturliga embryogenes betraktas som en logisk och effektiv metod för att få CPC.
Ett allmänt tillämpad metod för att erhålla CPC från ekonomiska och sociala råd är att aggregera ESCs i EBS 11. För att förbättra differentieringseffektiviteten, har definierade kemiska och tillväxtfaktorer som bygger på kunskap om hjärt utveckling använts 12-14. Det finns dock inga definitiva CPC markörer, särskilt inga cellytan markörer, som allmänt accepterade inom området. För att lösa detta problem, är ekonomiska och sociala råden konstruerad för att markera Isl1 + eller Mef2c + CPC och deras derivat med fluorescerande reportrar använder Cre / loxP-systemet. Cre-rekombinas slås in under kontroll av Isl1 / Mef2c promotor / förstärkare. Modifierad fluorescerande protein RFP eller YFP-genen som drivs av en konstitutiv promotor kan aktiveras genom excision av flox stoppkodonet med cre-rekombinas(ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP eller RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP) 5,6. När ESC differentieras till andra hjärtfält CPC, kommer Isl1 / Mef2c promotor / enhancer driven cre aktivera fluorescerande reportrar och CPC kan berikas av FACS-rening. I korthet är EB aggregering metod som används för att initiera ESC differentiering. För att öka differentiering effektivitet, är de differentierade cellerna behandlades med askorbinsyra (AA) och tillväxtfaktorer såsom BMP4, Aktivin A och VEGF 13,15. Detta protokoll möjliggör robusta och effektiva CPC differentiering med både mus och mänskliga ekonomiska och sociala råd.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E |
| Knockout SR | Life technology | 10828028 |
| Knockout DMEM | Life technology | 10829018 |
| DMEM | Life technology | 11965118 |
| NEAA | Life technology | 11140050 |
| GlutaMAX | Life technology | 35050061 |
| N2 | Life technology | 17502048 |
| B27 | Life technology | 12587010 |
| Ham’s F12 | Life technology | 11765062 |
| IMDM | Life technology | 12440061 |
| Pen/Strep | Life technology | 15140122 |
| Pyruvate | Life technology | 11360070 |
| Dispase | Life technology | 17105041 |
| Stempro-34 | Life technology | 10639011 |
| DMEM/F12 | Life technology | 11330032 |
| BSA | Life technology | 15260037 |
| Trypsin | Life technology | 25200056 |
| Ascobic Acid | Sigma | A5960 |
| 1-Thioglycerol | Sigma | M1753 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
| VEGF | R&D | 293-VE |
| Bmp4 | R&D | 314-BP |
| ActivinA | R&D | 338-AC |
| bFgf | R&D | 233-FB |
| Fgf10 | R&D | 345-FG |
| mTeSR | Stemcell technologies | 5850 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
Riferimenti
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
- Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
- Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Biologia dello sviluppo. 287 (1), 134-145 (2005).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
- Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
- Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).
