الخلايا الآكلة هي الخلايا الرئيسية resorbing العظام في الجسم. وقد أدت القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في تحقيق تقدم جوهري في فهم علم الأحياء ناقضة العظم. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لعزل وزراعة وقياس النشاط ناقضة العظم في المختبر.
الخلايا الآكلة هي الخلايا المتخصصة جدا التي هي مستمدة من النسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظام. قدرة فريدة ليرتشف كل من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام يعني أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم إعادة الهيكل العظمي. معا، وبانيات الآكلة هي المسؤولة عن عملية الربط الديناميكية التي تنطوي على حد سواء ارتشاف العظام وتكوين العظام تعمل معا للحفاظ على الهيكل العظمي العادي أثناء الصحة والمرض.
كما أن خلايا العظام resorbing الرئيسية في الجسم، ويمكن التغيرات في التفريق ناقضة العظم أو وظيفة يؤدي إلى آثار عميقة في الجسم. الأمراض المرتبطة ظيفة ناقضة العظم المتغيرة يمكن أن تتراوح في شدتها من أمراض حديثي الولادة قاتلة بسبب الفشل في تشكيل الفضاء لنخاع الدم، لاحظ أكثر شيوعا الأمراض مثل هشاشة العظام، والتي المفرط ارتشاف العظم ناقضة العظم يهيئ لكسر تشكيل.
وقد سمح الأنف والحنجرة "> القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في المختبر لتقدم كبير في فهم دورة إعادة تشكيل العظام ومهدت الطريق لاكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة أن مكافحة هذه الأمراض.هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل وزراعة الخلايا الآكلة من نخاع العظم الماوس التي من شأنها أن تسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة.
إعادة تشكيل العظام هو دينامية وينطوي على اقتران تكوين العظام مع ارتشاف العظم 1. هذه العملية للتنظيم محكم مسؤولة عن الحفاظ على الهيكل العظمي خلال التوازن الطبيعي، وردا على الاصابة والمرض.
الخلايا الآكلة هي الخلايا متعددة النوى الفريدة القادرة على resorbing كلا من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام. وتستمد الخلايا الآكلة من نسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظم 2-5. تشوهات في وظيفة أو تشكيل الخلايا الآكلة يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض السريرية، بما في ذلك الحالات الشائعة مثل مرض هشاشة العظام.
وقد سمح القدرة على توليد الخلايا الآكلة في المختبر لتقدما كبيرا في فهمنا للبيولوجيا العظام 6. ونتيجة لذلك، عوامل علاجية جديدة آخذة في الظهور لعلاج الأمراض المرتبطة ناقضة العظم المسؤولة عن الحالات المرضية والوفيات كبيرة 7 </sتصل>. صيانة التماثل الساكن من كتلة العظام وقوتها تتطلب اتخاذ إجراءات متضافرة من بانيات تشكيل العظام والخلايا الآكلة-resorbing العظام 8،9. يتم تبديل التوازن العظام في عدد من الأمراض، بما في ذلك مرحلة ما بعد انقطاع الطمث وهشاشة العظام، والتي زاد النشاط ناقضة العظم يؤدي إلى فقدان المسببة للأمراض من كتلة العظام وكثافتها 10. مع زيادة توافر نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الأمراض التي تصيب البشر، هناك المزيد من الفرص لفك دور الخلايا الآكلة في أمراض العظام البشرية 11-13.
ويبدو أن العديد من البروتوكولات لتقنيات زراعة ناقضة العظم في الأدب، مع العديد من الاختلافات وصفت 9،12،14. ووصف زملاء شينغ منهجية مماثلة لبروتوكول المبينة أدناه، في وصفها للفحوصات osteoclastogenic من خلايا نخاع العظام في الفئران. لكن للافراج عن خلايا نخاع العظام العظام الطويلة بعد الحصاد، شينغ وآخرون مسح تجويف نخاع مع α-MEM وسائل الإعلام كاملة14. Catalfamo يدرس تأثير ارتفاع السكر في الدم على وظيفة ناقضة العظم ويصف الطريقة التي حشدت من قبل جميع الخلايا نخاع العظم التنظيف ومثقف لمدة 24 ساعة، وعند هذه النقطة يتم تجاهل الخلايا غير ملتصقة 12، وهي تقنية تستخدم أيضا من قبل بويل وآخرون 9 هذه البروتوكولات نشرت سابقا تتطلب ممارسة بيغ نخاع العظام، وهي ممارسة شاقة، الذي يدخل أيضا من خطر الإصابة إبرة عصا وفقدان نخاع العظم قيمة، كما لا بد من قطع طرفي العظم. البروتوكول، الذي وصفنا، بتطبيق استخدام هاون ومدقة لعزل الخلايا الآكلة، وهي مشابهة لطريقة عزل بلعم صفها Weischenfeldt وآخرون (15).
تجربتنا، ومع ذلك، هو أن العزلة ناقضة العظم والثقافة في المختبر باستخدام تقنيات النتائج المنشورة سابقا في نتائج متفاوتة من حيث الإنتاج ناقضة العظم، مما يؤدي في كثير من الأحيانفي عدم القدرة على زراعة الخلايا الآكلة. لذا، قمنا بوضع البروتوكول الذي يسمح لعزل متسقة من نخاع العظم لإنتاج الماوس أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة متعددة النوى في المختبر، مع العائد التقريبي 70-80٪ من خلايا مطلي في البداية تشكيل الضامة والخلايا الآكلة في وقت لاحق، في حضور ناقضة العظم وسائل الإعلام تحريض.
وكانت القدرة على عزل بسهولة وزراعة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر مسؤولا عن المساعدة على تعزيز فهم البيولوجيا العظام والأمراض بوساطة ناقضة العظم. كان تحديد RANKL التي تؤدي إلى هذا، عندما تم التعرف عليه مؤخرا كمنظم رئيسي لتشكيل ناقضة العظم، والتمايز وال?…
The authors have nothing to disclose.
نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DE021683، R01 DE019434، U01 HL099776، مؤسسة ومختبر أوك Hagey للأطفال الطب التجديدي.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |