Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën
Summary
Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.
Abstract
TL-nanodeeltjes (NP) met de gewenste chemische, optische en mechanische eigenschappen zijn veelbelovend tools waarmee intracellulaire organellen te labelen. Hier introduceren we een methode met behulp van goud-BSA-rhodamine NP aan de endo-lysosomale systeem van eukaryote cellen te labelen en te monitoren manipulaties van gastheer cellulaire routes door de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica. De NP's waren direct geïnternaliseerd door HeLa-cellen en gelokaliseerd in de late endosomen / lysosomen. Salmonella-infectie veroorzaakte herschikking van de blaasjes en accumulatie van NP's in Salmonella geïnduceerde membraan structuren. We zetten de Imaris softwarepakket voor kwantitatieve analyses van confocale microscopie beelden. Het aantal objecten en hun grootteverdeling in niet-geïnfecteerde cellen werden verschillend van die in Salmonella geïnfecteerde cellen, wat aangeeft zeer remodelleren van de endo-lysosomale systeem WT Salmonella.
Introduction
TL-nanodeeltjes (NP), inclusief metalen NP, quantum dots, polymeer NP, silica NP, koolstof stippen, enz., Hebben veel aandacht gekregen in de afgelopen decennia 1,2. Vergeleken met traditionele organische kleurstoffen, fluorescerende NP vertonen wenselijke chemische, optische en mechanische eigenschappen, zoals sterk signaal sterkte, weerstand tegen fotobleken en hoge biocompatibiliteit 3,4. Deze voordelen maken ze de methode van keuze voor intracellulaire sensing en live cell imaging. Verder is een groot aantal elektron-dichte NP's zijn zichtbaar door elektronenmicroscopie (EM), het gebruik ervan voor gecorreleerde microscopische analyse, welke combinatie van live-cell tracking met een lichtmicroscoop (LM) en hogere resolutie op Ultrastructureel met EM-5 kunt faciliteren. Zo hebben goud NP lange tijd efficiënt als biosensoren in levende cellen voor gevoelige diagnoses en op het gebied van immuno-labeling 6 geweest. Recente studies aan dat goud NPs met verschillende grootte en vorm gemakkelijk kan opname door diverse cellijnen en routinematig transporteren door de endosomale route, daarom groot potentiaal toegepast intracellulaire vesikel transport volgen en de endo-lysosomale systeem labeling 7,8 .
Microbiële ziekteverwekkers, zoals Salmonella enterica, Shigella flexneri en Listeria monocytogenes, hebben verschillende mechanismen ontwikkeld om niet-fagocyterende gastheercellen 9 binnenvallen. Na te zijn geïnternaliseerd, de ziekteverwekkers, ofwel gelokaliseerd in het cytosol of afgezonderd in membraangebonden compartimenten, interactie uitvoerig met hun gastheer omgevingen en moduleren deze om hun eigen overleving 10 bevoordelen. Bijvoorbeeld, Salmonella enterica woont en repliceert binnen een intracellulaire phagosomal compartiment aangeduid als de Salmonella bevattende vacuole (SCV) na infectie 11. De rijping SCVtrafieken naar het Golgi-apparaat, dat voortdurend interacties met de endocytische route en induceert vorming van grote buisvormige structuren zoals Salmonella geïnduceerde filamenten (SIF), sortering nexine tubuli, Salmonella geïnduceerde uitscheiding drager membraaneiwit 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Bestuderen hoe deze bacteriële ziekteverwekkers manipuleren gastheer-cel trajecten is essentieel om inzicht besmettelijke ziekte.
Hier werden goud-BSA-rhodamine NP als vloeistof tracers aan de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem label en de menselijke maag pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) werd gebruikt als model bacterie om de interacties van de pathogeen het bestuderen hosten endocytose. Intracellulaire gold-BSA-rhodamine NPs in niet-geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met WT of mutante Salmonella stammen werden afgebeeld door confocale laser scanning microscoop (CLSM).Vervolgens werd Imaris software waarmee de verdeling van NP kwantificeren, wat aangeeft dat Salmonella infectie veroorzaakte extreme herschikking van de endosomen / lysosomen. Na de beschrijving van deze werkwijze kan analoog experimenten ontworpen lot op lange termijn van de geïnternaliseerde NP te volgen en om de invloed van verschillende exogene stoffen of endogene factoren op de endocytische route van eukaryotische cellen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De endo-lysosomale systeem van zoogdiercellen controleert belangrijke fysiologische processen, waaronder de opname van voedingsstoffen, hormoon-gemedieerde signaaltransductie, immuunsurveillance, en antigeen presentatie 17. Tot nu verschillende merkers zijn gebruikt voor het labelen van de endocytische route en tracking studies. Bijvoorbeeld, Lysotracker probes acidotropic fluorescerende probes ontwikkeld door Molecular Probes (Life Technologies, USA) lysosoom etikettering, die selectief kan ophopen in cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
Riferimenti
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella – at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
