Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari
Summary
Questo articolo descrive i metodi per la sintesi e l'etichettatura fluorescente di nanoparticelle (NP). Le NP sono stati applicati in esperimenti di pulse-chase di etichettare il sistema endo-lisosomiale di cellule eucariotiche. Manipolazione del sistema endo-lisosomiale dalle attività del patogeno intracellulare Salmonella enterica sono state seguite da imaging cellulare dal vivo e quantificato.
Abstract
Nanoparticelle fluorescenti (NP) con proprietà ottiche e meccaniche chimiche desiderabile, sono strumenti promettenti per etichettare organelli intracellulari. Qui, si introduce un metodo che utilizza oro-BSA-rodamina PN per etichettare il sistema endo-lisosomiale di cellule eucariotiche e monitorare manipolazioni di accoglienza vie cellulari dal patogeno intracellulare Salmonella enterica. Le NP sono stati prontamente internalizzati dalle cellule HeLa e localizzate in tardo endosomi / lisosomi. Infezione da Salmonella indotto riassetto delle vescicole e accumulo di NP in strutture a membrana Salmonella- indotte. Abbiamo implementato il pacchetto software Imaris per analisi quantitative di immagini di microscopia confocale. Il numero di oggetti e la loro distribuzione dimensionale in cellule non infette erano distinte da quelle in cellule -infected Salmonella, indicando estremamente rimodellamento del sistema endo-lisosomiale by WT Salmonella.
Introduction
Nanoparticelle fluorescenti (NP), comprese le nanoparticelle di metallo, i punti quantici, nanoparticelle polimeriche, NP di silice, punti di carbonio, ecc, hanno attirato una notevole attenzione nel corso degli ultimi decenni 1,2. Rispetto ai tradizionali coloranti organici, NP fluorescenti mostrano chimiche, proprietà ottiche e meccaniche desiderabili, come forte intensità del segnale, resistenza photobleaching ed alta 3,4 biocompatibilità. Questi vantaggi loro il metodo di scelta per il rilevamento intracellulare e imaging cellulare dal vivo fanno. Inoltre, una varietà di elettroni NP-dense sono visibili mediante microscopia elettronica (EM), facilitando il loro utilizzo per l'analisi microscopica correlata, che consente combinazione di cellule vive di inseguimento con microscopio ottico (LM) e la risoluzione superiore a livello ultrastrutturale con EM 5. Ad esempio, NP oro sono stati da tempo utilizzati in modo efficiente come biosensori nelle cellule sensibili per la diagnosi vita così come nel campo della immuno-etichettatura 6. S recentiTUDI indicano che NP oro con forme e dimensioni diverse possono essere facilmente assorbimento da una grande varietà di linee cellulari e trasportare regolarmente attraverso la via endosomal, hanno quindi grande essere potenziale applicato per il monitoraggio del trasporto intracellulare di vescicole e l'etichettatura sistema endo-lisosomiale 7,8 .
Agenti patogeni microbici, come la Salmonella enterica, Shigella flexneri e Listeria monocytogenes, hanno sviluppato diversi meccanismi di invadere le cellule ospiti non fagocitiche 9. Dopo essere stato interiorizzato, gli agenti patogeni, sia localizzate nel citoplasma o sequestrati in compartimenti di membrana, interagiscono molto con i loro ambienti host e modulano questi per favorire la propria sopravvivenza 10. Ad esempio, Salmonella enterica risiede e replica all'interno di un vano phagosomal intracellulare definito il -contenenti vacuolo Salmonella (SCV) dopo l'infezione 11. Il SCV stagionaturatraffici verso l'apparato di Golgi, subendo continue interazioni con il percorso endocitica, e induce la formazione di estese strutture tubolari, come Salmonella filamenti -indotta (SIF), ordinamento tubuli nexin, Salmonella carrier secretoria indotta proteine di membrana (3) SCAMP3 tubuli, etc . 12-14. Studiare come questi batteri patogeni manipolano percorsi host-cellule è fondamentale per la comprensione di malattie infettive.
Qui, NP gold-BSA-rodamina sono stati utilizzati come traccianti fluido per etichettare il cellulare sistema endo-lisosomiale di accoglienza, e l'umano patogeno gastrointestinale Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (Salmonella) è stato utilizzato come modello batterio per studiare le interazioni del patogeno con il ospiterà pathway endocitico. Intracellulari NP gold-BSA-rodamina nelle cellule e le cellule non infette infettate con WT Salmonella o ceppi mutanti sono stati ripresi da un microscopio confocale a scansione laser (CLSM).Poi software Imaris è stato utilizzato per quantificare la distribuzione di NP, che indica che l'infezione da Salmonella indotto estrema riassetto endosomi / lisosomi. Dopo la descrizione di questo metodo, gli esperimenti analoghi possono essere progettati per tenere traccia destino a lungo termine delle NP interiorizzato e per indagare l'influenza di varie sostanze esogene o fattori endogeni sulla via endocitica delle cellule eucariotiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema endo-lisosomiale di cellule di mammiferi controlla importanti processi fisiologici, tra cui l'assorbimento dei nutrienti, la trasduzione del segnale ormonale mediata, sorveglianza immunitaria, e l'antigene presentazione 17. Fino ad ora, una varietà di marcatori sono stati utilizzati per l'etichettatura dei pathway studi e monitoraggio endocitici. Ad esempio, le sonde LysoTracker sono sonde fluorescenti acidotropic sviluppati da Molecular Probes (Life Technologies, USA) per l'etiche…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
Riferimenti
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