Применение люминесцентных наночастиц по изучению ремоделирования Endo-лизосом Системе внутриклеточных бактерий
Summary
Эта статья описывает методы синтеза и флуоресцентных меток наночастиц (NPS). АПЛ были применены в импульсно-погони экспериментов для обозначения эндо-лизосомальное систему эукариотических клеток. Манипуляции с эндо-лизосомальных системы по деятельности внутриклеточного патогена Сальмонелла энтерика последовали живых клеток изображений и количественно.
Abstract
Флуоресцентные наночастицы (NPS) с желаемой химической, оптических и механических свойств перспективные методы этикетке внутриклеточных органелл. Здесь мы представляем метод с использованием золото-БСА RHODAMINE NPS для обозначения эндо-лизосомальных систему эукариотических клеток и контролировать манипуляции принимающих клеточных путей внутриклеточной возбудителя Сальмонелла энтерика. АПЛ были легко усвоены HeLa клеток и локализуется в конце эндосомах / лизосом. Сальмонеллез индуцированной перестройки пузырьков и накопления наночастиц в Salmonella- индуцированных мембранных структур. Мы развернули пакет программного обеспечения Imaris для количественного анализа конфокальной микроскопии изображений. Число объектов и их распределение по размерам в неинфицированных клетках отличались от тех, в Salmonella -infected клеток, что указывает на чрезвычайно ремоделирование эндо-лизосомальных системе WT Salmonella.
Introduction
Флуоресцентные наночастицы (NPS), в том числе металлических наночастиц, квантовых точек, полимерных наночастиц, кремния наночастиц, углеродных точек и т.д., привлекли значительное внимание в течение последних десятилетий в 1,2 раза. По сравнению с традиционными органических красителей, флуоресцентные наночастицы показывают желаемые химические, оптические и механические свойства, такие как сильный уровень сигнала, устойчивость к фотообесцвечивание и высокой биосовместимостью 3,4. Эти преимущества делают их метод выбора для внутриклеточного зондирования и получения изображений живых клеток. Кроме того, различные электронно-плотные НЧ видны с помощью электронной микроскопии (ЭМ), что облегчает их использование в коррелированной микроскопического анализа, который позволяет сочетание живой клетке отслеживание световой микроскопии (LM) и более высоким разрешением на уровне ультраструктуры ЭМ 5. Например, золото НЧ были давно эффективно использованы в качестве биосенсоров в живых клетках для чувствительной диагностики, а также в области иммуно-маркировки 6. Последние летtudies показывают, что золото НЧ с различным размером и формой может быть легко поглощать большим разнообразием клеточных линий и регулярно транспортировать через эндосомный пути, следовательно, имеют большой потенциал применяется для внутриклеточного слежения пузырьков транспортировки и эндо-лизосомальных системы маркировки 7,8 ,
Патогенных микроорганизмов, таких как Сальмонелла энтерика, Shigella Флекснера и листерий, разработали различные механизмы, чтобы вторгнуться без фагоцитоза клеток-хозяев 9. После того, как усвоены, возбудители, либо локализованные в цитоплазме или поглощенных в мембраносвязанных отсеков, широко взаимодействуют с окружающей их средой принимающих и модулировать их, чтобы способствовать их собственное выживание 10. Например, Сальмонелла энтерика находится, и повторяет в внутриклеточный phagosomal отсек называется Salmonella -содержащих вакуоль (SCV) при заражении 11. Со сроком погашения SCVтрафиков к аппарату Гольджи, проходит постоянного взаимодействия с эндоцитотического пути, и индуцирует образование обширных трубчатых структур, таких как Salmonella индуцированной нитей (SIF), сортировка нексин канальцы, Salmonella, индуцированной носители секреторной мембраны белка (3) SCAMP3 канальцев и т.д. 12-14.. Изучение того, как эти бактериальные патогены манипулировать клетке-хозяине путей имеет важное значение для понимания инфекционной болезни.
Здесь золото-БСА-родамина НЧ были использованы в качестве жидких индикаторов для обозначения узла сотовой системы эндо-лизосомами, и человеческий желудочно-кишечного патогена Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium (Salmonella) был использован в качестве модели бактерии изучить взаимодействие патогена с провести эндоцитотический пути. Внутриклеточные золото-BSA-родаминовые НП в неинфицированных клеток и клеток, инфицированных WT сальмонеллами или мутантных штаммов были обследованы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).Тогда программное обеспечение Imaris был использован для количественного определения распределения наночастиц, указывая, что сальмонеллез индуцированной крайней перестановку эндосомах / лизосом. После описания этого метода, аналогичные эксперименты могут быть разработаны, чтобы отслеживать долгосрочное судьбу интернализованного НП и исследовать влияние различных экзогенных веществ или эндогенных факторов на эндоцитоза пути эукариотических клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эндо-лизосомальных система клетках млекопитающих контролирует важные физиологические процессы, в том числе поглощения питательных веществ, гормонов опосредуется сигнальной трансдукции, иммунного надзора и презентации антигена 17. До сих пор, множество маркеров были использова…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
Riferimenti
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella – at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
